Progresele din biologia moleculară au influențat în mod semnificativ medicina modernă: ele nu numai că au aprofundat cunoștințele despre cauzele multor boli, dar au contribuit și la dezvoltarea de noi abordări în diagnosticul și tratamentul lor.
Pentru a detecta defectele în structura ADN, trebuie izolat de materialul biologic și "copiat" (dezvoltat) în cantități suficiente pentru studiu. Pentru terapia genică, este necesar să se izoleze genele normale și să se introducă în celule defecte astfel încât acestea să fie exprimate, permițând restaurarea sănătății pacientului.
Extracția ADN implică liza celulară rapidă, îndepărtarea fragmentelor de organele și membranele celulare prin centrifugare, degradarea proteinelor prin proteaze, extracția ADN-ului cu precipitarea ulterioară. În timpul izolării, se obțin molecule foarte mari, acestea fiind fragmentate în continuare prin enzime de restricție. Fragmentele rezultate sunt separate prin electroforeză. Numărul și lungimea fragmentelor rezultate și, în consecință, localizarea benzilor pe electrophograma este unică și specifică pentru fiecare persoană.
Identificarea secvențelor caracteristice se realizează prin hibridizarea Southern blot. Fragmentele ADN sunt supuse denaturării și transferării (blotting) la un purtător dens (filtru sau membrană). ADN-ul fixat pe filtru este hibridizat cu mici fragmente de ADN sau ARN conținând o etichetă radioactivă (fluorescentă sau altă). Astfel de fragmente se numesc sonde de ADN sau ARN. Dacă există secvențe în proba de testare care sunt complementare secvențelor de sondă, hibridizarea poate fi determinată vizual sau cu ajutorul unor instrumente speciale. Metoda este utilizată pentru a diagnostica bolile infecțioase, defectele ereditare, pentru a stabili expresia anumitor gene.
Sequencing (determinarea structurii primare) a ADN-ului se efectuează prin metoda chimică sau enzimatică. Metoda lui Maskam și Gilbert (chimic) se bazează pe degradarea chimică a ADN-ului. Esența metodei este după cum urmează: un capăt al fragmentului ADN este marcat cu o etichetă radioactivă sau fluorescentă. Prepararea ADN-ului marcat este împărțit în patru porții și fiecare dintre ele este tratat cu un reactiv care epuizeaza una sau două dintre cele patru baze, și condițiile de reacție sunt selectate astfel încât pentru fiecare moleculă de ADN au avut puține defecte. Ca rezultat, se obține un set de fragmente marcate, ale căror lungimi sunt determinate de distanța de la baza distrusă până la capătul moleculei. Fragmentele formate în toate cele patru reacții sunt supuse la electroforeză în patru benzi adiacente; apoi conduceți identificarea acestora. Prin poziția amprentelor, puteți stabili la ce distanță de la capătul etichetat a fost baza distrusă și cunoașteți această bază - poziția acesteia. Astfel, setul de benzi determină secvența de nucleotide a ADN-ului.
Metoda Sanger (enzimatică) se bazează pe modelarea reacției ADN polimerazei, în care molecula ADN care este studiată este folosită ca șablon. Se adaugă dideoxinucleotide la amestecul de reacție (nu există nici o grupare OH în poziția 3 'a pentozelor). ADN polimeraza include aceste precursori în ADN. Cu toate acestea, atunci când sunt încorporate în ADN, nucleotida modificată nu poate forma o legătură fosfodiesterică cu următoarea deoxiribonucleotidă. Ca rezultat, alungirea acestui lanț se oprește la locul unde dideoxiribonucleotida a intrat în ADN. Reacția se efectuează simultan în patru eprubete separate, fiecare conținând unul dintre cele patru dideoxinucleotide și toate trifosfat 4 deoxinucleotide (aceasta este de obicei atașat un marker radioactiv sau fluorescent). În fiecare dintre tuburi se formează un set de fragmente marcate de diferite lungimi. Lungimea lor depinde de locul unde nucleul defect este inclus în lanț. Fragmentele rezultate ADN marcate sunt separate pe un gel de poliacrilamidă la termen de o identificare nucleotidă se realizează și modelul de distribuție a fragmentelor din setul de patru eșantioane de secvență ADN nucleotidice.
Prepararea ADN-ului recombinant și amplificarea acestuia. În producerea ADN-ului recombinant, aceste molecule sunt izolate din două surse diferite. Fiecare dintre ele este fragmentată separat folosind aceeași enzimă de restricție. După procedeul de încălzire și răcire lentă a amestecului fragmentelor obținute, împreună cu moleculele originale de ADN, se formează ADN-uri recombinante, constând din părți ADN aparținând inițial unor probe diferite. Folosind tehnica ADN-ului recombinant, este posibil sa studiem variantele genelor responsabile pentru dezvoltarea multor boli. În acest fel, pot fi identificate diverse mutații.
Pentru a obține cantități semnificative de ADN material genetic de donare recombinant efectuat, sugerând inserția fragmentului ADN dorit într-o moleculă vector, penetrarea vector furnizează ADN-ul recombinant în celulele bacteriene. Atunci când bacteriile transformate se înmulțesc, crește numărul de copii ale fragmentului ADN inserat, precum și sinteza produselor proteice, care nu sunt caracteristice celulei bacteriene, dar sunt foarte valoroase pentru ființele umane. Vaccinurile, insulina, hormonul de creștere, factorii de coagulare etc. sunt obținuți în acest mod.
Lucrul cu secvențele nucleotidice necesită o cantitate suficientă de material pentru a fi studiată. Prin urmare, fragmentele ADN sunt pre-amplificate (crește cantitatea). Metoda reacției în lanț a polimerazei (PCR), propusă în 1983 de către Curry Mullis, permite ca orice mostre de ADN specifice să fie supuse unei amplificări specifice în condiții in vitro.
Reacția în lanț a polimerazei are loc în trei etape:
1. Denaturarea.
Un amestec de incubare care conține o probă de ADN dorit este încălzit la o temperatură de 90 ° C. În acest caz, timp de 15 secunde, legături slabe de hidrogen dintre lanțurile ADN sunt distruse și două molecule cu un singur catenar formează dintr-o moleculă dublu catenară.
2. Hibridizarea primerilor.
Temperatura este redusă la 50 ° C. În acest caz, lanțurile ADN hibridizează cu primeri. Această etapă durează de obicei 30 de secunde.
3. Polimerizarea.
Amestecul de incubare este încălzit la 70 ° C. La această temperatură, polimeraza elongă ambii primeri de la capetele lor 3 '. Grundurile cresc la dimensiunea matricei. Acest proces durează 90 de secunde. Ca rezultat, cantitatea de ADN se dublează.
Procedura se efectuează automat în dispozitiv - cicler termic (cicliscator, termocicletă). Acest dispozitiv vă permite să setați numărul dorit de cicluri și să alegeți parametrii optimi de timp și de temperatură. Folosirea PCR poate primi un număr suficient de copii ale ADN-ului, ceea ce sugerează prezența mutațiilor, situri polimorfisme, poate fi efectuat infecție diagnostic ADN la pacientii cu virusuri, bacterii și fungi.
Alte știri corelate:
informații
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: