Metode calitative și cantitative pentru determinarea iga, igg și igm

Imunoglobulinele sunt glicoproteine ​​secretate de celulele plasmatice. Dezvoltarea anticorpilor apare, de regulă, după stimularea antigenului. Cele mai multe antigene provoacă stimularea simultană a mai multor clone de limfocite B - stimulare policlonală. Anticorpii produși de o singură clonă de limfocite B - anticorpii monoclonali - sunt complet identici. Între anticorpii care sunt produși de diferite clone de limfocite B, există întotdeauna unele diferențe, de exemplu, în structura situsului de legare cu antigenul sau puterea de legare a antigenului. Sunt cunoscute cinci clase de imunoglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Structura de bază a moleculei de imunoglobulină din orice clasă este structură în formă de Y constă din două grele și două lanțuri ușoare legate prin punți disulfurice (vezi. Ch. 1, p. IV.A.4). „Ramurile“ ale moleculei (Fab-fragment) sunt utilizate pentru legarea antigenului, și „trunchi» (Fc-fragment) să îndeplinească alte funcții biologice: activează complementul, se leagă la membrana celulară și IgG etc sunt prezente în fluidele biologice sub formă de monomeri ... Acestea constituie majoritatea imunoglobulinelor serice și sunt principala clasă de imunoglobuline produse de răspunsul imun secundar. IgE, de asemenea monomeri, sunt implicați în reacții alergice de tip imediat. IgD se găsesc în principal pe membranele limfocitelor B și servesc drept receptori de recunoaștere a antigenului, în ser sunt prezenți într-o cantitate mică sub formă de monomeri. IgA conținute în ser predominant sub formă de monomeri, secreții mucoase și colostru - ca dimerii care conțin ca J-lanț și un component secretor, care este sintetizat în epiteliul mucos. IgA dimeric se leagă de componenta secretoare, trecând prin epiteliu la suprafața mucoasei. IgM sunt prezente în ser, în principal sub formă de pentameri. Ele formează cea mai mare parte a imunoglobulinelor produse de răspunsul imun primar. Metodele pentru studiul imunoglobulinelor includ determinarea nivelului de imunoglobuline din diferite clase și subclase și anticorpi la anumite antigene. La evaluarea rezultatelor studiului trebuie luat în considerare faptul că nivelul imunoglobulinelor depinde de vârstă (vezi anexele IV și V). Modificarea nivelului de imunoglobuline din ser poate fi o consecință a încălcării sintezei, catabolismului sau excreției lor.







2. Imunoelectroforeza. Esența metodei este următoarea: 1) separarea electrophoretică a proteinelor în gel; 2) la sfârșitul electroforezei în gel, canelurile sunt tăiate în paralel cu direcția de electroforeză; 3) o canelură este de anticorpi (antiseruri), cum ar fi greu (alfa, delta, epsilon, gama, miu) sau lumină (lambda, kappa) lanțuri de imunoglobuline. Acești anticorpi și proteinele separate prin electroforeză difuzează unul față de celălalt. În locurile în care anticorpii se leagă de proteine, se formează arcuri de precipitare (a se vedea figura 20.2). Imunoterapia face posibilă evaluarea numai a compoziției calitative a amestecului studiat de proteine. Evaluarea rezultatelor studiului necesită o calificare înaltă. Cel mai adesea această metodă este utilizată pentru detectarea și caracterizarea anticorpilor monoclonali.

3. Electroforeza cu imunofixare. Această metodă se bazează pe separarea electroforetică a proteinelor serice în gel urmată de incubarea gelului în prezența anticorpilor la lanțurile grele și ușoare ale imunoglobulinelor. Atunci când proteinele sunt legate de anticorpi, se formează complexe imune care pot fi văzute după colorare (vezi Figura 20.3). Complexele imune care conțin imunoglobuline normale sunt depozitate sub forma unei benzi largi, fuzzy, monoclonale - sub forma unei limite și mai clar definite. Această metodă este, de asemenea, calitativă, însă este mai sensibilă și mai simplă decât imunoelectroforeza. Electroforeza cu imunofixare este adesea utilizată în combinație cu imunoelectroforeza pentru determinarea imunoglobulinelor monoclonale sau oligoclonale.







B. Imunodifuzia radială dublă este o metodă semi-cantitativă care nu numai că poate detecta antigeni, ci și evaluează gradul de asemănare dintre acestea. Metoda este următoarea: 1) în godeurile tăiate în agar-agar, amestecul a fost introdus antigene și anticorpi investigați cu anticorpi specificitate cunoscută (în general gaura centrală de luare și dispuse în jurul acestuia - antigeni); 2) antigene și anticorpi difuzați unul spre celălalt; 3) la locul unde a avut loc legarea anticorpilor și a antigenilor, se formează benzi de precipitare. Prin aranjament reciproc și forma benzilor de precipitare, este posibil să se estimeze gradul de similaritate între antigeni localizați în godeurile adiacente. În prezent, această metodă este utilizată în diagnosticul bolilor autoimune pentru a identifica autoanticorpi la antigene nucleare extrase (vezi capitolul 15, paragraful II.D.2). Deși sensibilitatea metodei de imunodifuzie radiale duble inferioare multor metode cantitative, punct de vedere tehnic este simplu și nu necesită anticorpi de înaltă puritate, specifice și pot fi utilizate în timpul studiilor în masă.

D. NEFELOMETRIA - determinarea concentrației particulelor în suspensie și a substanțelor moleculare înalte în soluție, pe baza unei estimări a intensității dispersiei de lumină care trece prin această soluție. Petrometria poate fi utilizată pentru a determina concentrația de antigeni, deoarece atunci când se adaugă anticorpi, se formează complexe imune care împrăștie lumina transmisă. Nefelometria permite determinarea cu precizie a concentrației de IgG, IgA, IgM, subclasele IgG, C3, C4, factorul B, proteina C reactivă și alte proteine ​​din zer. Această metodă este adecvată pentru detectarea proteinelor în concentrații scăzute, de exemplu IgE, a căror concentrație serică nu depășește 1 μg / ml. În prezent, multe laboratoare utilizează nephelometria ca metodă standard de determinare cantitativă a imunoglobulinelor.

E. ELISA cu fază solidă. Ca fază solidă, plăcile de polistiren cu antigene sorbate sau anticorpi sunt cele mai des folosite. Determinarea anticorpilor la orice antigen se efectuează după cum urmează: 1) lichidul de testare este introdus în godeurile plăcii cu antigenul sorbit pe acestea; 2) în timpul incubării, anticorpii se leagă la antigen; 3) placa este spălată din anticorpii nelegați și se adaugă anticorpi la imunoglobuline (al doilea anticorp) marcat cu enzima; 4) placa se spală din nou, se adaugă substratul enzimei și cromogenul (substanță care schimbă culoarea în timpul reacției chimice); 5) sub acțiunea produsului reacției enzimatice, cromogenul modifică culoarea. Cu cât mai mulți anticorpi marcați cu enzime se leagă de complexele antigen-anticorpi, cu atât activitatea enzimatică este mai mare și intensitatea culorii soluției (a se vedea figura 20.5). Concentrația anticorpilor din probă se determină spectrofotometric în funcție de densitatea optică a soluției colorate. Aceeași abordare este utilizată pentru a determina antigenul din eșantion. În acest caz, se utilizează plăci cu anticorpi sorbiti la antigenul investigat, alți anticorpi marcați cu enzime sunt, de asemenea, direcționați către acest antigen (a se vedea figura 20.5). ELISA cu fază solidă este folosită pentru cuantificarea anticorpilor și a antigenilor. În ceea ce privește sensibilitatea, este comparabilă cu RIA, dar este mai simplă, mai ieftină și nu necesită utilizarea izotopilor radioactivi. Multe laboratoare folosesc ELISA de fază solidă ca metodă standard pentru determinarea anticorpilor antivirus, incluzând anticorpi pentru HIV, citokine și imunoglobuline (subclasele IgE și IgG).

J. Imunoblotting este o metodă calitativă care permite detectarea antigenilor și a anticorpilor în proba de testare. Anticorpii care utilizează această metodă sunt detectați după cum urmează: 1) un amestec de antigeni cunoscuți este separat prin electroforeză într-un gel de poliacrilamidă și transferat pe o membrană de nitroceluloză; 2) membrana este incubată cu proba de testare, de exemplu ser, și apoi cu anticorpi marcați la imunoglobuline. Pentru a identifica antigeni, proteinele probei de test sunt supuse separării electroforetice, care apoi sunt transferate în membrană, urmată de adăugarea de anticorpi marcați la antigeni cunoscuți. În prezent, sunt fabricate truse gata făcute pentru efectuarea imunoblotării. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru a confirma rezultatele testului ELISA solid în diagnosticul infecției HIV.

H. Alte metode de cercetare

1. Imunofluorescența indirectă este o metodă prin care se pot detecta anticorpi față de antigeni cunoscuți. Ca sursă de antigen, se utilizează de obicei secțiuni de țesut sau culturi celulare. Substratul transferat în diapozitiv este incubat în prezența probei de testare, de exemplu, ser, și apoi în prezența anticorpilor marcați cu fluorocrom la imunoglobuline. Anticorpii legați la substrat sunt detectați utilizând un microscop fluorescent. Această metodă este utilizată de obicei pentru a detecta anticorpi antinucleari și anticorpi la anumiți viruși. Deși metoda nu este cantitativă, este destul de sensibilă și simplă.

2. Metode bazate pe reacția de aglutinare. Pentru reacția de aglutinare, sunt de obicei folosite eritrocite (hemaglutinarea) sau particule de latex (aglutinare latex) acoperite cu un antigen cunoscut. În prezența anticorpilor la acest antigen, apare aglutinarea eritrocitelor sau a particulelor de latex. Hemaglutinarea este utilizată pentru detectarea anticorpilor la tiroglobulină și antigeni microzomali, aglutinarea latexului - pentru a detecta factorul reumatoid și alți anticorpi. Aceste metode sunt simple și permit cuantificarea antigenului, dar sunt mai puțin sensibile decât RIA și ELISA în fază solidă.







Articole similare

Pagina anterioară

Pagina următoare

Trimiteți-le prietenilor: