Peretele celular al bacteriilor este trăsătura lor importantă.
Pentru a studia mai bine structurile celulare ale bacteriilor, preparatele microbiologice sunt colorate. Puteți colora forme bacteriene vii, dar această culoare nu oferă o imagine completă a structurii celulei microbiene. În acest sens, se prepară preparate fixe de microorganisme. Fixarea ucide celulele vii și le fixează simultan pe suprafața diapozitivului.
Prepararea preparatelor colorate fixe include prepararea unui frotiu, uscarea, fixarea și colorarea.
Pregătirea unui frotiu. O picătură mică de apă de la robinet este plasată pe un pahar degresat cu alcool și o cantitate mică de material de testare este transferată în ea printr-o buclă, ca în cazul preparatului "picătură zdrobită". Suspensia rezultată este uniform diluată cu o bucla pe o suprafață de 1 - 2 cm cât mai subțire posibil. Frotiul trebuie să fie atât de subțire încât să se usuce rapid după gătit.
Uscarea frotiului se face cel mai bine la temperatura camerei în aer. Un frotiu subțire bine pregătit se usucă foarte repede. Dacă uscarea este lentă, preparatul poate fi ușor încălzit într-un jet de aer cald deasupra flacării arzătorului, păstrând frotiul de sticlă în sus. Această operație trebuie efectuată cu grijă, fără supraîncălzirea frotiului, altfel celulele microorganismelor sunt deformate.
Fixarea medicamentului are mai multe scopuri: distrugerea microorganismelor, adică asigurați o manipulare suplimentară în siguranță; asigura o adeziune mai buna a celulelor la sticla; Faceți o frotiu mai susceptibil la colorare, deoarece celulele moarte sunt colorate mai bine decât celulele vii. Cea mai obișnuită metodă de fixare este tratamentul termic.
Pentru aceasta, preparatul se efectuează de obicei de trei ori prin partea cea mai fierbinte a flacării arzătorului, menținând glisiera în poziție cu un accident vascular cerebral. Nu supraîncălziți frotiu, deoarece acest lucru duce la schimbări bruște în structurile celulare și, uneori, la apariția celulelor, de exemplu, încrețirea lor. Pentru a studia structura fină a celulelor recurge la fixarea cu diferite substanțe chimice. Lichidul de fixare este turnat pe o frotiu sau preparatul este imersat într-un pahar cu o soluție de fixare pentru o anumită perioadă de timp.
Colorat. Celulele microorganisme sunt colorate în principal cu coloranți anilinici. Distingeți între vopselele acide și cele de bază. Pentru acide sunt coloranți, în care proprietățile de colorare ale anionului, în principal coloranți cromoforul este un cation. Exemple de coloranți acide sunt eozina. eritrozină, nigrozină, acufenă; toate se leagă intensiv de componentele citoplasme ale celulei. Principalele coloranți - albastrul de metilen, fucsina de bază, violetul de gențian, violet cristal, safranin - se leagă mai intens la componentele nucleare ale celulei. Concentrația ridicată a ADN-ului și a ARN-ului ribozomal în celula bacteriană o face mai sensibilă la coloranții de bază. În acest sens, în practica microbiologică se folosesc aproape exclusiv coloranți de bază.
Distingerea între colorarea simplă și diferențiată a microorganismelor. În primul caz, întreaga celulă este colorată, astfel încât forma și dimensiunile sale să fie clar vizibile. Colorarea diferențială arată numai anumite structuri celulare și substanțe de rezervă.
Pentru colorarea simplă a celulelor de microorganisme, fucsinul, violetul de gențian, albastrul de metilen sunt cele mai des folosite. Preparatul fix este plasat pe bastoane de sticlă paralelă situate deasupra tăvii, se aplică o soluție de colorant și se menține timp de 1 până la 3 minute. Asigurați-vă că, în timpul vopsirii, vopseaua de pe frotiu nu se usucă și, dacă este necesar, se adaugă o nouă porție a colorantului.
Până la sfârșitul preparării culorii se spală cu apă, atâta timp cât apa curgătoare este incoloră. Apoi medicamentul este uscat în aer sau blotat usor cu hârtie de filtru, plasat pe picatura vopsita de ulei de imersie si vizualizat cu un obiectiv de 100x. Pentru obținerea preparatelor mai pure, vopseaua se aplică pe o frotiu acoperit cu hârtie de filtru. Metoda de colorare în modificarea Sineva face posibilă utilizarea hârtiei de filtru pre-impregnată cu ea în locul soluției de colorant. Într-un preparat bine colorat și bine spălat, câmpul vizual este luminos și clar, numai celulele sunt colorate.
Fixul și culoarea pot fi, de asemenea, droguri - "printuri". Preparatele fixe colorate pot fi stocate mult timp.
Forma celulelor și localizarea lor (lanțuri, rozete, pachete, tetrade etc.), de obicei, dezvăluie "picătură zdrobită" pe preparatele cu microscopie cu câmp light-light sau cu contrast de fază. Pentru a determina forma celulelor de bacterii mici în formă de tijă, cum ar fi Serratia marcescens. pregătiți pregătirea celulelor fixe și aplicați o simplă colorare. Celulele de bacterii mici, care au proteze prolate (genuri de Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella și altele), sunt investigate în mod adecvat prin metoda contrastului de fază sau într-un câmp întunecat. aranjament natural al celulelor din colonie de microorganisme și spori și sporoforilor actinomicete și fungi filamentoși studiu pe droguri „amprenta“.
Trebuie amintit că vârsta culturii, compoziția mediului și condițiile de cultivare afectează în mod semnificativ morfologia și citologia microorganismelor.
Gram gram (colorarea complexă a microorganismelor) și utilizarea sa pentru diferențierea bacteriilor cu structură diferită a peretelui celular.
Această metodă de colorare complexă (utilizând mai mult de un ingredient activ) a fost inițial propusă în 1884. Danezul H. Gram (Ch.Gram) pentru vopsirea țesuturilor, și mai târziu a fost utilizat pe scară largă în colorarea procarioților și a fost numit după dezvoltatorul său.
Importanța metodei de colorare Gram în microbiologie este determinată de faptul că rezultatele bacteriilor colorante sunt direct legate de caracteristicile structurale ale pereților celulelor lor. Explicația acestui fenomen sunt diferențe în structura pereților celulelor de bacterii Gram-pozitive (conform metodei de colorație în violet) igramotritsatelnyh marcat (conform metodei de colorație în culoare roșie) bacterii. Prima dintre acestea sunt suficient de straturi groase de murein (y eubacteriile) sau psevdomureina (y archaebacterii) formate în reținerea de protoplaști complex „cristal violet iod +“ și împiedicând levigarea acestuia din celula în alcool de prelucrare ulterioară.
In bacteriile gramnegative turn astfel heteropolizaharide nu formează sau conține mici cantități insuficiente pentru a împiedica extragerea complexului colorant cu iod din protoplastică în timpul procesării alcoolului. Cele de mai sus explică de ce, în ciuda simplitatea aparenta a metodei de Gram, a fost cel care a primit cea mai mare distribuție ca o semnificație importantă taxonomică a testului, rezultatele care se corelează bine multe alte proprietăți ale procariote.
Pentru punerea în aplicare a acestei metode, prepararea unui colorant - soluție Guides de violet de gențiană sau cristal violet: 1 g de colorant se triturează într-un mojar cu 2 g de acid carbolic cristalin la consistența terciul, se adaugă în porțiuni mici de alcool 10 ml de 96%, în final, se diluează cu 100 ml apă distilată se toarnă într- sticlă, se ridică și se filtrează după o zi. A doua componentă importantă pentru colorarea Gram este soluția lui Lugol. în 10 ml de apă distilată se dizolvă 2 g de iodură de potasiu și 1 g de iod cristalin, amestecul a fost bine sigilat și lăsat timp de o zi, după care 300 ml apă distilată.
Procedura pentru colorarea Gram începe cu tratamentul celulelor bacteriene fixe cu un colorant violet de cristal, urmat de tratarea celulelor cu soluție de iod. Aceste două componente formează împreună un complex de molecule mari, insolubil în apă și puțin solubil în alcool. Prin urmare, folosind un alcool, celulele sunt diferențiate: spălarea în ea celulele „grampozitivi“ păstrează complexul „violet cristal iod +“ și să rămână albastru și „Gram-negative“ decolorat. Pentru a le face vizibile, probele sunt în plus colorate cu un colorant roșu contrastant, de obicei fuchsin.
Dintre numeroasele variante propuse în prezent, colorarea Gram (conform GP Kalina, conform lui Etkins și colab.), O modificare a A.I. Albastru. pentru realizarea căruia s-au preparat benzi de hârtie de filtru preparate anterior, impregnate cu o soluție de violet cristalin și uscate.
Procedură pentru colorarea complexă a microorganismelor:
1) pe glisieră se prepară o frotiu de culturi bacteriene care este fixată deasupra flăcării arzătorului;
2) o bucată de hârtie de filtru, impregnată cu o soluție de violet cristalin, este plasată pe o frotiu pe care se aplică 2-3 picături de apă și se menține timp de 2 minute;
3) scoateți hârtia de filtru;
4) fără spălare cu apă (!) Se aplică 2-3 picături de soluție Lugol la preparat și se menține timp de 1 minut;
5) soluția de scurgere a soluției Lugol;
6) coborâți diapozitivul într-un pahar cu alcool 95%, unde clătiți bine medicamentul timp de 0,5-1 minute, până când colorantul nu mai curge;
7) clătiți bine cu apă;
8) se aplică o soluție de fuchsină apoasă pe un tobogan și se pătrunde preparatul timp de 0,5-1 minute;
9) colorantul este drenat, spălat bine cu apă, uscat în aer și microscopat.
Se crede că, în majoritatea cazurilor, interpretarea rezultatelor petelor Gram nu prezintă dificultăți, ci unele microorganisme gram-pozitive, în special reprezentanți ai genului Bacillus. poate avea o colorare gram-negativă. În schimb, unele tulpini de gene gram-negative Acinetobacter și Moraxella nu au tendința de a decolora cu alcool, așa că par a fi Gram-pozitive.
Pentru a clarifica astfel de reacții "gram-discutabile", se propun metode speciale. În Japonia a fost propusă o metodă de "stratificare" care face posibilă distingerea microorganismelor gram-negative de bacterii gram-pozitive cu ajutorul testului KOH. Metoda cu KOH se bazează pe capacitatea peretelui celular de bacterii gram-pozitive de a menține integritatea atunci când este expus la hidroxid de potasiu, în timp ce peretele celular al microorganismelor gram-negative este distrus de această expunere.
O picătură de soluție apoasă 3% KOH este aplicată pe diapozitiv. Bucla este introdusă în cultura de agar zilnic a bacteriilor aflate în studiu și este foarte emulsificată. Dacă reacția este pozitivă, în cazul în care suspensia în picătură devine vâscoasă, firele de umplutură se extind dincolo de bucla cu 0,5-2,0 cm și chiar mai departe, sunt bacterii Gram-negative, dacă nu, bacterii Gram-pozitive. Contabilitatea pentru această mostră este mai convenabilă pe un fundal negru.
Formarea unei consistențe mucoase după tratamentul bacteriilor KOH gram-negative se datorează eliberării ADN-ului din celule, care este o componentă vâscoasă.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: