Restricția ADN-ului genomic în fragmente și clonarea fragmentelor cu ajutorul vectorilor diferiți au creat baza pentru formarea bibliotecilor genomice.
Construcția de biblioteci genomice înseamnă construirea acelor fragmente ADN. care sunt folosite pentru secvențiere. Există două opțiuni pentru construirea acestor biblioteci:
· Tehnici in vivo caracteristice tehnicilor de generare I, AVANTAJE: bibliotecile create in vivo pot fi folosite pentru alte lucruri. de exemplu, în cartografierea genomului
Abordare ierarhică
· In vitro-caracteristic pentru tehnicile de a doua generație, este mai convenabil de utilizat
Luați abordarea cu pușca
Biblioteca genomică. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Trebuie remarcat faptul că este mai bine să se folosească fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.
Molecula circulară ADN purificată este digerată cu o enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este tratat cu aceeași enzimă de restricție, adăugată la plasmidă, se adaugă ligaze. Astfel, se obține un ADN plasmidic recombinant, care este introdus în celule bacteriene sau de drojdie. Plasmidul replică cu formarea multor copii. Multe plasmide poartă o genă pentru rezistența la antibiotice și dacă există o astfel de genă într-o plasmidă recombinantă, atunci celulele pot fi ușor detectate prin creșterea pe un mediu antibiotic.
Fiecare astfel de colonie este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide poate fi numit o bibliotecă de ADN genomic. Dezavantajul acestei metode este că fragmentele ADN se formează într-o cantitate enormă. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.
CDNA bibliotecă. Crearea ADNc începe cu sinteza pe template-ul ARN folosind transcriptaza inversă a catenei complementare a ADN-ului. Se creează apoi condiții alcaline, lanțul ARN este defalcat în nucleotide, după care se sintetizează o lanț ADN complementar utilizând ADN polimeraza. În același timp, se formează un fragment ADN cu capete bont. Un astfel de ADN este inserat în plasmide și introdus în celulele bacteriene. Când se amplifică plasmida, se formează o clonă a unei copii complementare a ADN (cADN).
Avantaje pentru a clona ADN genomic clone de ADN care codifică o proteină, secvența de nucleotide a genei nu întreruptă.
Grupele geniene conțin introni care trebuie să fie îndepărtați din ARN-ul transcripției înainte de a-l converti într-un matrice ARN urmat de splicing. Celulele bacteriene nu pot efectua o astfel de modificare a ARN, formată prin transcrierea genei unei celule eucariote. Prin urmare, dacă se dorește obținerea de proteine prin exprimarea unei gene clonate, este mai bine să se utilizeze o bancă cADN derivată din ARN matriceal.
Vectori - adaptate pentru clonarea fragmentelor extraterestre ale moleculelor de ADN care au în componența lor:
1. Originea replicării (Ori)
2. marker selectiv (gena rezistenței la antibiotice)
3. Situri de restaurare, convenabile pentru clonare.
De asemenea, vectorii pot include:
· Genele care controlează propagarea copiilor vectorului între celulele fiice (pentru vectorii cu copie redusă)
· Secvențe telomere (pentru vectori liniari)
Vectorii folosiți în proiectele genomice
2. Vectorii de fagi
4. Cromozomi artificiali
Plasmidele. pUC. 90% din secvențe sunt făcute pe această plasmidă. În cazuri foarte rare, este luat un alt vector, dar același tip este o mică plasmidă bacteriană de mare amploare. Este folosit, pentru că Acest număr mare de copii plasmidă prezentă în celula de până la 1000 de copii, este ușor de izolat și concentrația sa în preparat este mare, astfel încât este ușor de curățat. ADN de înaltă calitate este obținut, .... Din punct de vedere tehnologic, un astfel de vector asigură cea mai înaltă calitate a secvenței, astfel încât cea mai mare parte a secvențierii se face pe astfel de plasmide. În plus, procesul care utilizează o plasmidă cu copie mare este ușor de robotizat. Dezavantaje asociate copiilor mari:
Unele fragmente de clone de ADN genomic este practic imposibilă în aceste plasmide, ca chiar si o gena normala celulare, în cazul în care numărul de copii crește de multe ori, poate fi toxic pentru celule. Genele genetice genele pot fi, de asemenea, toxice pentru o celulă bacteriană. 5-10% din genomul din acest vector nu poate fi clonat datorită problemei de toxicitate.
În astfel de vectori, nu se poate clona fragmente ADN extinse mai lungi decât mai multe așa-numitele p. Când se introduc inserții pUC pentru 20-30 așa-numitele. plasmidele devin instabile; capacitatea de copiere a plasmidei este aceeași, aproximativ 50% din ADN-ul din celulă poate fi plasmidă. Există o presiune selectivă puternică pentru a reduce cantitatea de ADN. Procesele de recombinare continuă, reorganizarea, în primul rând eliminările și inversiunile, poate fi destul de ușoară. Orice rearanjare a plasmidei în direcția scăderii va fi preluată prin selectarea naturală. Relativ stabile sunt inserții cu o dimensiune nu mai mare de 1,5-2 kp.
Vectorii fagi. Ei au întotdeauna mai multă capacitate: dacă vectorul de inserție, capacitatea este de aproximativ 10? așa numit. dacă vectorul de înlocuire a fagului lambda este de 20? așa numit. În plus, atunci când se înmulțește bacteriofagul, nu există nici o problemă de toxicitate, deoarece în timpul reproducerii celulare fagului moare în orice caz, iar fagul de a reproduce și pachetul ADN-ul său în timp. Acesta este singurul motiv pentru care vectorii de fagi sunt încă utilizați în proiecte genomice. Cu excepția unei situații foarte exotice în genele donate în vector fag nu are nici o șansă de a preveni multiplicarea fagului, și dacă alegeți tulpinile potrivite de fagi, problemele cu mai puține rearanjamente. Se crede că înlocuirea vectorilor fagi sunt suficient de stabile, iar acestea sunt încă utilizate în proiecte genomice mari, atunci când aveți nevoie pentru a închide lacunele care nu pot fi clonate în alte biblioteci. Dezavantaje: ADN-ul fagului să aloce mult mai puțin convenabil (tehnica mai complicată, mult mai intensiv forța de muncă, dificil de a automatiza). Prin urmare, vectorii de fagi sunt de obicei utilizați în faza de finisare, când trebuie să închideți golurile.
Cosmic vector. Este un hibrid al plasmidei și bacteriofagului. Imaginea este incorectă: ar trebui să existe 2 cosuri. Până la începutul anilor 90, aceștia au fost vectori cu o capacitate maximă (crescut de 2 ori comparativ cu un bacteriofag). Marimea cosmodului: 53 so.n. (Maxim, care este plasat în capul fagului lambda), minus mărimea vectorului - o kb 45-51 capacitate. Un cosmad normal poartă 2 cosuri, pentru că fagul în mod normal împachetează un ADN liniar în cap între două cosuri. Prepararea bibliotecii de cosmide - o procedură mult mai consumatoare de timp, dar aceste biblioteci sunt considerate bibliotecile de bună calitate, ca și în cazul în care a produs un titru înalt al particulelor de bacteriofagi, ADN-ul nu este biblioteca reamplificat necesară și menținut stabil pentru o lungă perioadă de timp. În orice moment, este posibil să se infecteze astfel de celule bacteriene cu celule bacteriene și să se obțină genele corespunzătoare.
Cromozomi artificiali de drojdii. Aceste vectori sunt special concepute pentru proiectul "Genomul uman". Acest program a început oficial la sfârșitul anilor '90. Prima etapă a proiectului a fost dezvoltarea de vectori. Vectorii special concepute pentru proiect, cu o capacitate maximă care poate fi prezentată pe baza mecanismului de segregare de replicare și cromozomul de drojdie. Au fost dezvoltate, bibliotecile au fost construite pe ele. Capacitatea vectorului de drojdie standard este de aproximativ 600 bp. și mega-YAC - 1,4 miliarde de euro. Ie puteți obține 6-7 mii de clone și acesta va fi întregul genom uman. Am lucrat cu ei de 5 ani, a primit o bibliotecă, și undeva la mijlocul anilor '90 a devenit clar că aceste clone de drojdie cu insertii mari sunt foarte instabile. ADN-ul este stocat slab, acesta trebuie să fie menținut în drojdie, iar apoi există aceeași situație ca și cu inserții mari în plasmidele de bacterii, numai într-o versiune mult mai severă: multiple interne de reorganizare, ștergeri, translocații, etc. Cu biblioteca prokartirovannnye atât de greu legat de un card fizic sa dovedit a fi ceva care nu se potrivesc, pentru că nu este ADN-ul, care a fost în genomul uman inițial.
Trimiteți-le prietenilor: