In clonarea moleculară a inserției dorite este un fragment de ADN la o altă moleculă de ADN care este capabil de replicare (informații codificate în secvența de baze ADN parental este transmis cu ADN precizie filială) într-o celulă gazdă adecvată. Moleculele ADN folosite pentru a transfera materialul încorporat în celulele bacteriene sunt numite vectori. Această încorporare se realizează in vitro și apoi ADN-ul recombinant rezultat este introdus în celule.
Molecucul vectorial trebuie să conțină în mod necesar originea replicării - ori. În plus, pentru replicare sunt necesare enzime specifice și factori auxiliari ai proteinei. Sursa lor este celula gazdă sau sunt codificate de vectorul însuși. Un vector poate fi orice element extrachromozomic mic - plasmidă, ADN de virus fag sau ADN, cosmide, phasmide.
Cele mai utilizate pe scară largă o astfel de combinație, atunci când, în rolul maestru protrudes tulpina E. coli K12, și rolul vectorului - diferite plasmide și bacteriofagilor E. coli. Utilizarea preferată a tulpinii datorită faptului că tocmai în celulele de E. coli K12 nestânjenită replicat multe bacteriofagi și plasmide care pot fi utilizate ca un vector potențial utili, iar această tulpină este cel mai studiat.
Clasificați plasmidele în trecut din prezența segmentelor ADN modulare în ele. Fiecare segment modular poate conține una sau mai multe gene sau elemente care acționează cis, cum ar fi, de exemplu, locusul ori. Fiecare plasmidă trebuie să aibă cel puțin un modul de replicare care să îi permită să se înmulțească extensiv în celula destinatarului. Prezența altor module, altele decât replicarea, nu este obligatorie pentru fiecare plasmidă.
Factori sexuali, numiți plasmide conjugative. (de exemplu, plasmida F) au module de conjugare care conțin gene și regiuni de reglare necesare pentru transferarea plasmidei de la o celulă la alta. Unele dintre plasmidele neconjugative (fără modulul de conjugare) pot fi transferate de la o celulă la alta dacă sunt combinate într-o celulă donator cu un factor de sex.
Modulele de tip diferit conțin gene ale căror produse proteice oferă inactivarea antibioticelor. Plasmidele care transportă astfel de module sunt deseori numite R-plasmide (de la rezistența în engleză). Adesea, o plasmidă oferă rezistență la mai multe antibiotice, iar mai multe sau chiar toate tipurile diferite de rezistență pot fi grupate împreună într-un singur modul.
Există un alt tip de modul care apare în compoziția atât a plasmidelor conjugative cât și a celor neconjugative - acestea sunt modulele col. Modulele col sunt gene care codifică una din mai multe proteine - colicine - agenți antibacterieni produși de bacterii. Colicinele diferă în ceea ce privește structura și mecanismul de acțiune. Foarte adesea colozidimii care codifică o colicină specială conțin gene care asigură imunitatea la acest colicin, protejând astfel celulele producătoare de leziuni cauzate de propriul agent de protecție.
Plasmidele găsite inițial în natură au fost ulterior modificate, scurtate, reconstruite și recombinate atât in vivo, cât și in vitro. Scopul tuturor acestor manipulări a fost să obțină plasmide universale sau, dimpotrivă, plasmide destinate rezolvării unor probleme experimentale specifice. Cele mai bune dintre ele au conținut marcatori genetici, permițând simplificarea selecției acelor celule bacteriene care au inclus molecule recombinante.
În plus față de faptul că markerii genetici fac posibilă izolarea clonelor de celule bacteriene care conțin o plasmidă recombinantă, acestea îndeplinesc o altă funcție importantă. Dacă plasmida nu își îndeplinește funcția în anumite condiții, celulele cresc de obicei și se înmulțesc mai eficient în absența ADN extrachromozomal "extra". Prin urmare, acele celule care pierd plasmida rapid depășesc altele, în timp ce recombinanții sunt eliminați. Altfel, dacă celulele sunt în astfel de condiții, atunci când viabilitatea lor depinde de plasmidă, celulele care au pierdut vectorul sunt eliminate.
Proprietățile unui vector plasmidic ideal. Vectorul plasmidic ideal pentru clonarea moleculară trebuie să satisfacă următoarele cerințe:
1. vectorul trebuie să conțină o cantitate minimă de ADN;
2. Replicarea vectorilor ar trebui să fie reglementată de tipul de slăbită - (care conduce la apariția multor copii ale plasmidelor în celulă), și nu un control strict pentru a asigura un randament ridicat al ADN-ului;
3. Vectorul trebuie să conțină cel puțin doi markeri selectabili și să aibă un situs de recunoaștere pentru endonucleaza de restricție. Ultima proprietate permite tăierea ADN-ului circular într-un loc unic, care este apoi ligat cu o inserție;
4. pentru selectarea cea mai simplă a transformanților, un sit de restricție unic ar trebui să fie localizat în unul din cei doi markeri selectabili;
5. Inserția nu trebuie să întrerupă secvența necesară pentru conservarea plasmidei în sine.
Dintre toate vectorii care lucrează cu E. coli, cea mai populară este plasmida pBR322. Această plasmidă are multe proprietăți ale unui vector ideal pentru clonare. Deoarece pBR322 replicat Col tip E1 (Col-E1 este o plasmidă care este capabil de a acumula câteva mii de copii ale unei plasmide genomului, chiar si atunci cand celula creste si nu este divizat), ADN-ul plasmidic poate fi obținut cu un randament ridicat. Plasmidul conține două gene marker selective care conferă rezistență la tetraciclină și ampicilină. Fiecare dintre cele 12 de restricție site-uri de recunoaștere a enzimelor în molecula este găsit doar o singură dată, permițându-vă pentru a primi o varietate de molecule liniare cu capete „lipicioase“. Secvența nucleotidică completă a acestui vector este cunoscută în lungimea a 4362 de perechi de nucleotide.
Celule E. coli. conține plasmida pBR322, au fost crescute în mediu cu ampicilină sau tetraciclină sau în prezența ambelor antibiotice și celulele care au pierdut plasmida nu cresc în prezența fie antibiotic. Dacă un fragment ADN este introdus pentru pBR322, responsabil pentru rezistența la tetraciclină (de exemplu, un situs de restricție Bam HI sau Sal I), atunci astfel de transformanți păstrează capacitatea de a crește pe mediu cu ampicilină, dar nu cresc pe mediu ce conține tetraciclină. Dacă inserția are loc în funcție de gena ampicilinei (la punctele de restricție Pvu I sau Pst I), atunci se observă situația opusă. Cu orice locație de inserție, este ușor să selectați numai acele colonii de celule bacteriene care poartă ADN plasmidic recombinant.
Molecula de ADN a fagului l, constând din 48502 perechi de baze de nucleotide, include originea replicării precum și gene care codifică proteine virale structurale si enzime necesare pentru replicarea ADN-ului, liza celulelor infectate și pentru a stabili lysogeny. Aproximativ 30% din genom este reprezentat de o zonă care nu este necesară pentru o infecție litice. De regulă, multe sau chiar toate genele necesare pentru lysogenesis eliminate, astfel încât infecția cu E. coli vector recombinant este întotdeauna însoțită de liza celulelor gazdă.
Fage M13 aparține grupului bacteriofagilor filamentoși E. coli. Genomul de fag este reprezentat de ADN inelular monocatenar. ambalate într-o capsidă. Fage M13 este capabil să infecteze celulele T.coli numai dacă au F-pili.
Astfel de vectori hibrizi includ cosmide și phasmide.
Cosmid - un tip de vectori hibrizi care sunt caracterizate prin tipul de replicare plasmidic și au capacitatea de a fi ambalate în condiții in vitro, în capul fagului l. cosmidian tipică conține originea de replicare cuprinde situsuri de restricție unice și markeri de selecție care aparțin ADN-ului plasmidic, care este integrat cu un fragment de ADN de fagi l, conținând fage capete „lipicios“ (cos -cayty). Celulele gazdă beneficiare devin ambalate în cosmide virioni cauzate de infecția cu particule de fag „false“. Odată ce în celulă, ADN-ul recombinant este amplificat și depozitat în acesta ca plasmidă.
Cosmidele sunt, în esență, vectori plasmidici care au doar situs cos de fag, care este necesar pentru a realiza ambalarea eficientă a ADN-ului recombinant in vitro.
Hibridplasmidele adevărate și fagi sunt phasmids - molecula de ADN duplex liniar, care sunt situate la capetele segmentelor ADN ale fagului l, conținând toate genele necesare pentru infectia litic, în timp ce partea din mijloc prezintă plasmida linearizată. Funcțiile de replicare ale fagului și ale plasmidei în phasmide sunt pe deplin conservate. De obicei, astfel de vectori conțin mai multe repetiții ale porțiunii plasmidei asigurării necesare pentru ambalarea lungimii ADN-ului genomic. Una sau mai multe repetări plasmidice în construirea ADN-ului recombinant sunt înlocuite cu o inserție adecvată.
ADN-urile phasmid înainte de infecție sunt ambalate in vitro în capete de fagi. Intrarea în celula E. coli. Fazmida este reprodusă ca ADN fag, rezultând formarea plăcilor pe peluza celulelor sensibile. Cu toate acestea, dacă vectorul conține o genă care codifică un represor de fagă, atunci fazmul replică ca plasmidă, mai degrabă decât ca un fag.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: