Metode de fracționare și purificare a proteinelor

• precipitarea cu solvenți organici;

• distribuția în sisteme cu două faze.

După cum se știe, dizolvarea proteinelor în apă datorită hidratării moleculelor individuale care duce la formarea în jurul moleculei de proteină de apă (hidratare) cochilii, constând orientate într-o anumită formă de molecule de apă spațiu. Această apă (carcasa hidratată) diferă de solventul pur. Soluțiile de proteine ​​se caracterizează prin instabilitate extremă și sub influența diverșilor factori care încalcă hidratarea, proteinele precipită cu ușurință. Prin urmare, adăugarea la soluția de proteină a oricărui agent de deshidratare (alcool, acetonă, soluții concentrate de săruri neutre ale metalelor alcaline) și efectul factorilor fizici (căldură, iradiere) duce la deshidratarea moleculelor și precipitarea lor în nămolul.







Salting out. Când proteina este precipitată cu săruri ale metalelor alcaline și alcalino-pământoase, proteina, de obicei, nu își pierde capacitatea de a se dizolva din nou în apă după îndepărtarea sărurilor (dializă, filtrare pe gel). De exemplu: globulinele precipită la saturație de 50% și albuminele la 100% saturație a soluției cu sulfat de amoniu. Atunci când molecula de proteină este precipitată, este foarte importantă nu numai concentrația de săruri, ci și temperatura și puterea ionică a soluției.

Metode de cromatografie. Metoda de cromatografie, dezvoltată în 1903 de către omul de știință rus M.V. Culoare, în funcție de capacitatea pigmenților (sau a altor substanțe) de a se lega în mod specific de adsorbantul închis în coloană; Procesele de sorbție și desorbție sunt de asemenea utilizate. Sunt utilizate diferite metode de cromatografie: adsorbție, cromatografie cu schimbare ionică, schimbare ionică.

Cromatografia adsorbantă - adsorbantul este cărbune activ, oxid de aluminiu sau siliciu. Utilizată pe scară largă pentru separarea proteinelor și a altor substanțe.

Cromatografie de distribuție. În acest caz, faza solidă este doar un purtător pentru faza lichidă. Tipuri: cromatografie pe hârtie, pe coloane, în cazul în care amidonul sau gelul de silice este utilizat ca fază staționară.







Cromatografia cu schimb de ioni. Rășinile schimbătoare de rășină sunt compuși organici polimeri care conțin grupări funcționale capabile să se implice în schimbul de ioni.

Există schimbătoare de anioni (baze organice și amine), schimbătoare de cationi care conțin grupări fenolice, sulfo și carboxil. Sunt utilizate pe scară largă dietilaminoetil celuloza (DEAE-celuloză), trietilaminoetil (TEEA) și celuloza de aminoetil (AE).

cromatografie de afinitate (afinitate sau cromatografia) se bazează pe principiul interacțiunii selective cu substanțe proteice specifice fixate pe suport. Sefaroză activată cu bromcian (CNBr-Sepharose) este utilizat ca purtător la care este atașată o varietate de substanțe - substrat, coenzima, antigen, hormon, etc. Metoda permite prepararea într-o singură etapă a unui preparat proteic înalt purificat.

Filtrarea pe gel sau metoda de site moleculare - este folosită pe scară largă pentru a purifica proteinele din impurități.

Folosind Sephadex (dextran, o polizaharidă de origine microbiană, tratat cu proteina separat) pot fi proteine ​​separate cu greutăți moleculare diferite, deoarece cereale Sefadex camere diferite au diferite dimensiuni porilor, care sunt capabile să penetreze anumite proteine ​​cu greutate moleculară.

Electroforeza se bazează pe diferența de viteză de proteine ​​într-un câmp electric, care este determinată de mărimea încărcăturii proteinei în anumite pH și tărie ionică a soluției. Inițial, metoda dezvoltată de A. Tizeliusom recent utilizat pe scară largă metoda electroforezei zone a proteinelor în diferite medii - pe hârtie (celuloză), amidon, gel de poliacrilamidă. Metoda disc-electroforeză în gel de poliacrilamidă permite obținerea a până la 50 de fracții de proteine, adică are o rezoluție foarte înaltă.

Focalizarea izoelectrică a proteinelor - pe amfoline permite izolarea proteinelor individuale în cantități preparative.

Ultracentrifugare într-un gradient de densitate de zaharoză sau cesiu clorură a fost utilizat pe scară largă pentru purificarea și determinarea greutății moleculare a proteinelor prin constanta de sedimentare (unitate Svedberg - S).

Purificarea proteinei din impuritățile moleculare mici se realizează prin dializă, filtrare pe gel, cristalizare, ultrafiltrare. Când se utilizează dializă, membranele semipermeabile (celofan, film coloidal), ale căror diametre ale porilor variază foarte mult. Proteinele, de regulă, nu difuzează printr-o astfel de membrană, iar substanțele moleculare cu un nivel scăzut de moleculare trec cu ușurință în mediul înconjurător. Cele mai bune rezultate sunt obținute prin metode de filtrare pe gel și ultrafiltrare. oferă o oportunitate, atât pentru a scăpa de componentele moleculare scăzute, cât și pentru a concentra proteinele.

Metode pentru determinarea omogenității proteinelor. Cele mai bune rezultate sunt obținute prin ultracentrifugare într-un gradient de densitate, prin disc-electroforeză în gel de poliacrilamidă, prin metode imunochemice.







Articole similare

Pagina anterioară

Pagina următoare

Trimiteți-le prietenilor: