Această metodă este mai universală. Cantitatea de virus (titru de virus) este măsurată într-o doză eficientă de 50% - ED50.
1 ED50 = o doză de virus care poate provoca un efect infecțios în 50% din obiectele testate infectate.
Pentru fiecare virus, este selectat un obiect de testare sensibil la acesta - animale de laborator (de obicei, soareci albi), embrioni de pui sau culturi celulare. Efectul sau efectul infecțios al virusului asupra diferitelor sisteme de testare se pot manifesta prin deces, simptome clinice, modificări pathoanatomice și efect citopatic. La animalele de laborator și la embrioni de pui, efectul virusului este evaluat în doze letale și infecțioase:
1 LD50 - o doză de virus care ucide 50% din animalele de laborator;
I ELD50 - o doză de virus care ucide 50% din embrionii pui;
1 ID50 - o doză de virus care provoacă simptome clinice sau modificări patologice la 50% din animalele de laborator infectate;
1 EID50 - o doză de virus care provoacă modificări patologice la 50% din embrionii de pui infectați.
În cultura celulară, efectul virusului este evaluat printr-un efect sau o acțiune citopatică (CPD):
1 CPV50 este doza de virus care provoacă un efect citopatic în 50% din tuburile cu o cultură de celule infectate.
Numărul ED50 (DL50 ELD50, ID50 și TSPD50 EID50) virus conținute într-o unitate de volum de material care conține virusul este un titru de expresie a virusului în acest material. Astfel, T înregistrare = 103.48 TSPD50 / 0,1 ml înseamnă că fiecare 0,1 ml de material care conține virusul este conținut 103.48 doze, fiecare dintre care pot provoca un efect citopatic în 50% din eprubete cu cultura de celule.
Metoda de titrare a virusurilor cu 50% acțiune infecțioasă este potrivită pentru titrarea aproape a oricărui virus, dacă selectați un sistem de testare sensibil la viață. Dezavantajul este complexitatea, durata și necesitatea calculului statistic.
Metoda de determinare a titrului virusului în unități de acțiune infecțioase 50% (DL50 ELD50, ID50, EID50 și TSPD50) este de a găsi o diluare a materialului care conține virusul testat în cantitate de doză infecțioasă care să conțină un ED50 și apoi calcula cât de multe astfel de unități virusul este conținut în același volum de material care conține virus. Acesta va fi titrul virusului. Pentru a face acest lucru:
1) un număr de diluții consecutive de 10 ori sunt preparate din materialul conținând virusul aflat în studiu. Numărul de diluții trebuie să fie mai mare (adică, atât de mult încât ultima cea mai mare nu are deja un efect infecțios). Pentru 10 diluții consecutive în fiecare din 10 eprubete sterile se toarnă la 9 ml de ser fiziologic steril și apoi introduse lin în primii 1 ml de suspensie. Se amestecă conținutul primului tub, se ia 1 ml de amestec și se adaugă la al doilea tub, se amestecă conținutul și 1 ml de la al doilea tub în al treilea și așa mai departe,
2) aceleași volume din fiecare diluție a materialului care conține virusul infectează testul viu sensibil la virusul dat. Fiecare grup necesită cel puțin 4-6 obiecte de testare (pentru certitudine statistică);
3) după expirarea timpului, luați în considerare rezultatul acțiunii virusului asupra obiectelor infectate (moarte, boală, modificări patologice sau efect citopatic). Moartea animalelor de laborator, CE pentru prima oară timp de 48 de ore, este considerată nespecifică. Contabilitatea se încheie după 2 - 3 zile de la rezilierea cauzei;
4) determinarea în care diluție virusul și-a manifestat efectul asupra a 50% din obiectele sensibile. Efectul virusului este determinat în LD50, ELD50, ID50, EID50 și CPD50. Se crede că doza din această diluție corespunde cu 1 ED50. Doza de virus se numără prin diverse metode (conform lui Reed și Mench, Kerber).
Pentru titrarea din materialul conținând virusul aflat în studiu, se prepară o serie de diluții consecutive de zece ori de la 1:10, adică se prepară. 10 -1 la 1: 10.000.000, adică 10-7. și mai mult (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, etc.). Numărul de diluții depinde de titrul așteptat al virusului, trebuie să fie gătit atât de mult încât ultima (cea mai înaltă) diluție nu mai are efect infecțios. Acțiunea infecțioasă a virusului (magnitudinea efectului infecțios) cu fiecare diluție scade proporțional cu logaritmul diluției (sau dozei). Adică, la o diluție de 1: 100 (10-2), efectul infecțios scade de două ori, dacă este de 1: 1000 (10-3) de trei ori și așa mai departe.
Fiecare diluție a materialului care conține virus de testat într-un anumit volum identic grupuri egale infecta sensibile la acest obiect de virus viu testat (animale de laborator, embrioni de pui, culturi de țesuturi). Acest lucru ia în considerare tropismul și dozele de virus, acceptate în general pentru această metodă de introducere a materialului. În fiecare grup ar trebui să existe cel puțin 4-6 obiecte de testare, deoarece cu o cantitate mai mică de procesare statistică materialul va avea prea multe erori.
Cu toate acestea, atunci când se determină titrul unui virus, este foarte dificil să se aleagă astfel de diluții, astfel încât una dintre ele să provoace exact moartea a 50% dintre animalele infectate. Adesea, atunci când titrarea numărului de animale vii și moarte este inegală. În acest caz, pentru o definiție mai precisă a titrului, metoda propusă de Reed și Menchem este larg utilizată în virologie. Ei recomandă titrarea pentru a lua în experiment un număr mare de grupuri de 4-6 modele sensibile în fiecare grup. Abaterea de la valoarea reală a DL50 datorate utilizării unor cantități mici de animale de testare din grupul este corectat în faptul că atunci când se calculează mortalitatea procentuală operează cu datele mortalității cumulative (cumul - acumulare).
Metoda lui Reed și Mench se bazează pe premisa logică că animalele (și alte modele) ucise prin infecție cu orice diluție a virusului, de exemplu 10-5. va muri și atunci când va fi infectat cu o diluție mai mică (10-4.10-3) a virusului. Dacă animalul nu se încadrează la o diluție dată, acesta va rămâne în viață, chiar dacă este infectat cu o diluție mai mare (10 -6, 10 -7). Pe această bază, rezultatele obținute sunt supuse interpolării și sunt exprimate ca date cumulate, pe baza cărora se calculează% mortalitate.
Când se calculează datele cumulate ale șoarecilor care au murit de la o diluție mai mare, se adaugă la numărul de decese din diluția mai mică. Șoarecii rămași în viață de la diluția mai mică se adaugă la numărul de animale care nu au fost omorâți de diluția mai mare (direcția este indicată de o săgeată). După obținerea datelor cumulate,% mortalitate este determinată. Procentul de mortalitate pentru fiecare diluție se calculează prin formula:
% letalitate = numărul de persoane căzute (date cumulate) / număr de date infectate (cumulative) × 100
Diluțiile, în care mortalitatea% este aproape de 50%, se numește cea mai mare și cea mai mică doză critică.
LD50 este determinat de formula:
,
unde LD50 este diluția dorită a virusului; B - reproducere, cauzând decesul a peste 50% din animale; b - procentul de mortalitate corespunzător diluției B; a - procentaj de mortalitate, corespunzător reproducerii, care are ca rezultat decesul a mai puțin de 50% din animale; d este factorul de diluare.
Titrul virusului, exprimat într-un număr cu exponent fracțional, este de obicei lăsat în această formă. Se poate transforma cu ușurință într-o valoare absolută folosind tabelul de antilogaritmi (tabele matematice de 4 cifre ale lui Bradys). Conform tabelului cu antilogaritmi, se constată valoarea absolută a diluției corespunzând la 1 LD50.
Articole similare
-
Întrebarea nr. 28 "Titrul virusului și principiile definiției sale în ceea ce privește 50% infecție"
-
Determinarea colitei și indicele coli al apei prin metoda filtrelor cu membrană
Trimiteți-le prietenilor: