Există două abordări ale clonării ADN-ului. Prima abordare implică utilizarea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru a multiplica ADN-ul străin introdus în ele. A doua metodă este amplificarea ADN in vitro.
Clonarea ADN-ului in vivo
Folosind microorganisme, puteți crea două tipuri de biblioteci ADN: genomice și clone.
Biblioteca genomică. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Trebuie remarcat faptul că este mai bine să se folosească fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.
Molecula circulară ADN purificată este digerată cu o enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este tratat cu aceeași enzimă de restricție, adăugată la plasmidă, se adaugă ligaze. Astfel, se obține un ADN plasmidic recombinant, care este introdus în celule bacteriene sau de drojdie. Plasmidul replică cu formarea multor copii. Multe plasmide poartă o genă pentru rezistența la antibiotice și dacă există o astfel de genă într-o plasmidă recombinantă, atunci celulele pot fi ușor detectate prin creșterea pe un mediu antibiotic.
Fiecare astfel de colonie este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide poate fi numit o bibliotecă de ADN genomic. Dezavantajul acestei metode este că fragmentele ADN se formează într-o cantitate enormă. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.
CDNA bibliotecă. Crearea ADNc începe cu sinteza pe template-ul ARN folosind transcriptaza inversă a catenei complementare a ADN-ului. Se creează apoi condiții alcaline, lanțul ARN este defalcat în nucleotide, după care se sintetizează o lanț ADN complementar utilizând ADN polimeraza. În același timp, se formează un fragment ADN cu capete bont. Un astfel de ADN este inserat în plasmide și introdus în celulele bacteriene. Atunci când plasmida este amplificată, se formează o clonă a unei copii complementare a ADN-ului.
Avantajele ADN-ului clonat în fața clonelor de ADN genomic sunt că proteina care codifică secvența nucleotidică a genei nu este întreruptă.
Gene genele genunchi conțin introni care trebuie să fie îndepărtați din ARN-ul transcripției înainte de a-l converti într-un ARN de matrice, urmat de splicing. Celulele bacteriene nu pot efectua o astfel de modificare a ARN, formată prin transcrierea genei unei celule eucariote. Prin urmare, dacă se dorește obținerea de proteine prin exprimarea unei gene clonate, este mai bine să se utilizeze o bancă cADN derivată din ARN matriceal.
Biblioteci genomice, clonarea ADN in vivo
După ce ADN-ul este cusut într-un tub de testare, acesta trebuie multiplicat, adică clona. Scop: obținerea de copii multiple ale genelor dorite. Pentru a clona fragmente mici de ADN, se folosesc plasmide sau ADN fag, pentru cele mari - cosmide și cromozomi artificiali.
Există două abordări ale clonării ADN-ului:
1) utilizarea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru a multiplica ADN-ul străin introdus în ele.
2) amplificarea ADN in vitro.
Folosind microorganisme, puteți crea două tipuri de biblioteci ADN: genomice și clone.
Biblioteca genomică este o colecție de clone ADN care include toate fragmentele care intră în genomul acestei specii. Adică, banca genetică poate fi numită în continuare un set de fragmente clonate ale genomului. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Este mai bine să utilizați fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.
Pentru a crea o bancă de gene, aveți nevoie de:
1) izolarea întregului ADN genomic
2) fragmentarea ADN-ului prin enzime de restricție sau ultrasunete
3) Moleculele circulare ADN purificate sunt tratate cu aceeași enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este adăugat la plasmidă în prezența ligazelor. În acest fel, un ADN plasmidic recombinant
4) recDNA este introdusă în celule bacteriene sau de drojdie, unde plasmidul replică pentru a forma multe copii.
5) Bacterii de clonare: fiecare colonie de celule emergente este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide formează o bibliotecă de ADN genomic.
Dezavantajul. fragmentele de ADN se formează în cantități imense. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.
Demnitate: biblioteca de gene poate fi stocată și folosită pe o perioadă nedeterminată.
-material sursă pentru studierea structurii, funcției și reglementării genelor individuale, structura și funcția proteinelor
-conservarea genotipului speciilor pe cale de dispariție
Colecții similare obținute din cromozomi individuali sau din părți ale acestora se numesc biblioteci cromozomiale.
Clonarea ADN-ului. Etapele de clonare a ADN-ului. Enzime de restricție. Restricție. Endonucleazei.
Clonarea ADN in vivo implică 6 etape:
1) obținerea de fragmente de ADN, incluzând gene sau părți ale acestora, prin enzime de restricție;
2) recombinarea fragmentelor,
3) introducerea unui fragment ADN într-un vector;
4) transformarea cu vectorul organismului gazdă;
5) screening pentru un vector recombinant
6) selectarea cercetătorilor de clonă interesați.
Unele enzime de restricție, precum și secvențele de nucleotide pe care le recunosc și situsurile de restricție din aceste secvențe
Enzime de restricție. Restricție. Endonucleazei.
În fiecare cromozom uman există o singură linie continuă de ADN. Este dificil de ambalat pentru a se încadra în cromozom. Este practic imposibil să se manipuleze cu o moleculă de ADN de această lungime.
Prin urmare, descoperirea în anii 70 ai secolului XX. enzime bacteriene specifice. taierea ADN-ului în fragmente separate, a fost foarte utilă. Enzimele au fost denumite enzime de restricție sau endonucleaze.
În bacterii, aceste enzime servesc pentru a proteja împotriva introducerii în celulă a ADN străin. În mod tipic, enzimele de restricție recunosc așa-numitele secvențe palindromice de nucleotide, observate în două catene de ADN și constând din 4-6 nucleotide.
Exemple de câteva enzime de restricție sunt prezentate în tabel.
Biblioteci genomice, clonarea ADN in vivo.
După ce ADN-ul este cusut într-un tub de testare, trebuie multiplicat, adică clona. Scop: obținerea de nenumărate copii ale genelor dorite. Pentru a clona fragmente mici de ADN-uri cu plasmide sau ADN fag, pentru cosmodele mari și pentru cromozomii artificiali.
Există două abordări ale clonării ADN-ului:
1) introducerea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru reproducere introduse în ADN-ul lor străin.
2) amplificarea ADN in vitro.
Folosind cele mai mici organisme, puteți crea două tipuri de biblioteci ADN: genomice și clone.
Biblioteca genomică este o colecție de clone ADN, incluzând toate piesele care sunt incluse în genomul acestei specii. Adică, o bancă de gene poate fi numită în continuare un set de fragmente clonate ale genomului. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, conectat în vectori plasmidici sau virali și inserat într-o celulă, atunci în această formă se poate păstra. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, posibilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistoale", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de piese separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, prin urmare, vom examina folosind exemplul de plasmide. Este mai bine să utilizați fagi ADN din ADN viral deoarece acestea au o capacitate imensă și vă permit să introduceți bucăți mai mari ale genomului.
Pentru a crea o bancă de gene, aveți nevoie de:
1) izolarea întregului ADN genomic
2) fragmentarea ADN-ului prin enzime de restricție sau ultrasunete
3) Moleculele circulare ADN purificate sunt tratate cu aceeași enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este adăugat la plasmidă în prezența ligazelor. Astfel, un ADN plasmidic recombinant
4) recDNA este introdusă în celule bacteriene sau de drojdie, unde plasmidul replică pentru a forma multe copii.
5) Clonarea microbilor: orice colonie emergentă de celule este o clonă sau descendentă a unei celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic și o colecție de plasmide formează o bibliotecă de ADN genomic.
Dezavantaj: fragmente de ADN se formează în cantități nelimitate. Decuparea ADN-ului genomic este determinată de caz, deoarece doar o fracțiune din fragmente conțin genele reale. Unele bucăți pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronice.
Demnitate: biblioteca de gene poate fi stocată și folosită pe o perioadă lungă de timp.
-materialul sursă pentru studiul structurii, funcției și reglementării genelor personale, structura și funcția proteinelor
-conservarea genotipului speciilor pe cale de dispariție
Astfel de colecții, obținute din cromozomii personali sau din părți ale acestora, se numesc biblioteci cromozomiale.
Poate că veți fi interesat de lucrări similare cu: bibliotecile genomice, clonarea ADN in vivo.
Gestionarea conținutului cu sursă deschisă
Noi scriem și decidem cu privire la Microbiologie orice subiecte și întrebări! Îndeplinirea în cel mai scurt timp posibil la prețuri plăcute! Completați formularul de mai jos și veți primi un răspuns în decurs de 15 minute.
Clonarea genelor este o procedură care implică izolarea și amplificarea genelor individuale în celulele receptorilor, pro sau eucariote. Cu ARN-ul de informații, izolat de același tip de celule corp, eliminați copii ADN. care sunt apoi introduse în celulele receptor și amplificate. Clonarea ADN in vivo implică 4 etape:
4) transformarea cu vectorul organismului gazdă;
5) screening pentru vectorul recombinant
6) selectarea cercetătorilor de clonă interesați.
Celulele receptorilor - celulele alese pentru a clona o genă pot fi atât pro-și eucariote.
ARNm este izolat din celule sau țesuturi în care este exprimată gena dorită.
Sinteza copiilor ADN se realizează prin ADN polimeraza dependentă de enzima ARN. La asta
enzima a început să funcționeze, este necesar un primer scurt de ADN cu un singur catenar; în acest scop, utilizați de obicei oligo. ADN-ul de semințe formează spontan un complex dublu catenar cu un segment poli.
Depolimerizarea lanțului inițial de ARN se realizează prin hidroliză alcalină. Lanțuri de ADN
rezistent la tratamentul alcalin, iar ARN complet depolimerizat. ADN-ul rezultat este monocatenar.
ADNc dublu catenar este obținut prin completarea ADN-ului ss-cADN într-o formă dublu catenară efectuată de enzima ADN polimerază I. Un astfel de cADN poate fi inserat într-un vector.
Există două tipuri principale de vectori: plasmide bacteriene și bacteriofagi.
Plasmidele sunt elementele extrachromozomale găsite în celule, care sunt molecule circulante închise ale dsDNA. Pentru a include cADN în plasmidă, inelul închis al plasmidei trebuie să fie "deschis". Pentru aceasta, plasmidele sunt supuse la enzime de restricție.
Restrictase - taie dsDNA prin anumite secvențe de nucleotide, numite situsuri de restricție.
Reticularea este o procedură în care ADN străin este inserat între este o procedură care este necesară datorită faptului că multe ARNm-uri diferite sunt prezente în preparatul inițial cADN și doar o porțiune din plasmide poartă gena de care avem nevoie.
Amplificarea se datorează faptului că multe copii ale plasmidei de interes pot fi sintetizate într-o celulă bacteriană, precum și prin obținerea unui număr mare de celule cu astfel de plasmide. După izolare și purificare, plasmidele sunt tratate cu enzima de restricție corespunzătoare, care taie copii ale genei dorite încorporate în ele. Gena astfel amplificată poate fi utilizată pentru experimente ulterioare în domeniul ingineriei genetice.
Surse: www.biotechnolog.ru, studopedia.ru, dommedika.com, reftrend.ru, biologymic.ru
Trimiteți-le prietenilor: