Clonarea genelor este o procedură care implică izolarea și amplificarea genelor individuale în celulele receptorilor, pro- și eucariote. Aceste celule care conțin gena dorită pot fi utilizate pentru a produce: a) o cantitate mare de proteină codificată de către gena; b) un număr mare de gene în sine într-o formă foarte purificată.
Procesul de clonare a genelor implică mai multe etape:
1. Obținerea genei necesare:
a) prin scindarea ADN-ului genomic prin endonuclează de restricție (endonuclează digerând o moleculă de ADN într-un loc strict definit);
b) prin sinteză chimică numai fragmente de ADN mici (deoarece cunoscând secvența resturilor de aminoacizi din molecula de proteină, este întotdeauna posibil să se determine secvența de nucleotide a fragmentului de ADN care codifică proteina conform codului genetic). Astfel, prin sinteza chimică, s-a obținut o genă responsabilă de sinteza somatostatinei;
c) din celulele corpului izolate molecule de ARNm și utilizând enzima revers transcriptază (ARN polimerază dependentă de ADN în a) a fost deprotejat copie ADN a genei dorite. De exemplu, din celulele insulare ale pancreasului, s-au izolat ARNm care transporta informații despre sinteza insulinei. Și din celulele infectate cu virusuri, ARN-urile sunt, de asemenea, izolate, care conțin informații despre sinteza interferonului.
2. Introducerea fragmentului ADN izolat sau obținut în compoziția moleculei de ADN vector - obținerea ADN-ului recombinant. Un vector este ceva asemănător unui "taxi" molecular, capabil să transporte ADN-ul altcuiva într-o celulă bacteriană, astfel încât să se poată replica acolo. Există două tipuri principale de vectori plasmide bacteriene (adesea responsabile pentru rezistenta la două sau mai multe antibiotice) și moderată defecte (în măsură să pună în aplicare transducție) bacteriofagi.
Plasmida este digerată cu o enzimă de restricție la un anumit loc. După scindarea capetele sale, cum ar fi capetele de clonare a ADN-ului selectat cu transferază terminală „doraschivat“, astfel încât porțiunile de capăt ale plasmidelor au fost încorporate ADN complementar (sau un alt spune „prost gust“). Mai mult, datorită interacțiunii secvențelor "lipicioase" și cu ajutorul enzimelor speciale, ADN-ul ligază legăturile încrucișate (ligate) inserția ADN și plasmida ADN. Noua moleculă de ADN circulară rezultată este denumită ADN recombinant.
3. Introducerea ADN-ului recombinant în celula receptor. Celulele selectate pentru clonarea genelor pot fi atât pro-și eucariote. Cel mai adesea, bacteriile sunt folosite în acest scop, deoarece cultivarea lor nu este o problemă mare (E. coli, B. subtilis, etc.). Dar dacă gena este izolată prin metoda 1, atunci ea trebuie clonată în celule eucariote, de exemplu drojdie. Introducerea ADN-ului recombinant se realizează prin transformare (crește permeabilitatea peretelui celular bacterian, într-o soluție diluată de clorură de calciu) sau transductia (în cazul utilizării ca vector bacteriofag).
4. Selectarea bacteriilor transformate. Deoarece nu toate celulele bacteriene din amestecul de reacție vor fi transformate, este necesar să se selecteze celule care conțin bacterii recombinante. Selecția se bazează de obicei pe faptul că plasmidele conferă rezistență la anumite antibiotice, și, prin urmare, bacteriile care conțin plasmida se va replica în prezența antibioticului adecvat.
5. Cultivarea celulelor transformate. Cultivarea celulelor selectate este necesară pentru a construi biomasa în scopul amplificării genelor în celulele receptor.
6. Izolarea produsului proteic al genei sau izolarea ADN-ului inserat din plasmidele purificate.
Prepararea anticorpilor monoclonali (MCA)
Principalele metode de inginerie celulară modernă sunt hibridizarea (sau fuziunea) și reconstrucția celulară. Metoda de hibridizare a celulelor face posibilă unificarea chiar a microorganismelor complet diferite, precum și celulelor vegetale, animale și umane.
Fuziunea celulelor se efectuează fie prin tratarea celulelor cu polietilenglicol, fie prin acțiunea impulsurilor electrice scurte. Celulele hibride rezultate - hibridoamele - au două seturi de cromozomi și combină proprietățile ambelor celule "părinte".
În 1974, Millstein și Keller au hibridizat limfocite normale din splina unui șoarece imunizat la celule de șoarece mielom. produs de fuziune a anticorpului la celulele tumorale - hibridoame care produc anticorpi de specificitate una (un singur determinant antigenic) și capabilă de creștere nelimitată in vitro.
ICA este utilizat pe scară largă pentru a diagnostica multe infecții bacteriene și virale (hepatită B, gripă, herpes, bruceloză); determinarea antigenilor de țesut, receptorilor și mediatorilor limfocitelor; pentru diagnosticarea și tratamentul tumorilor maligne (ICA a fost dezvoltată care reacționează cu cancerul pulmonar, cancerul de sân, colon, cancer pancreatic specific).
Tematica rapoartelor pentru conferința de instruire
1. Istoria dezvoltării biotehnologiei.
2. Biotehnologia și rezolvarea problemelor de mediu.
3. Biotehnologia: noi oportunități în diagnostic și tratament.
4. Preparate medicamentoase noi.
5. Oportunități și perspective ale ingineriei genetice.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: