Mycoplasmele sunt procariote care nu au un perete celular și sunt limitate doar de o membrană cu trei straturi. Ei au polimorfism (cocci, filamente, structuri ramificate), cresc pe medii nutritive fără celule. În legătură cu lipsa pereților celulari sunt sensibili la șocul osmotic. Pentru a preveni liza osmotică în compoziția mediilor nutritive includ săruri de stabilizare și alte substanțe. Mycoplasma patogenă să crească pe medii artificiale necesită adăugarea componentelor set-GIH că acestea nu sunt în măsură să se sintetizeze. Compoziția mediilor trebuie să includă serul ca o sursă de lipoproteine. Împreună cu steroli, fosfolipide, mame mikoplaz lipide patogene necesită o proteină cu greutate moleculară mică. În legătură cu cele de mai sus, micoplasma este crescută pe medii cu ser, extracte de drojdie, mușchi inimii, adăugarea lipidelor membranare sau a precursorilor lor.
Temperatura optimă pentru Mycoplasma, Ureaplasma si aholeplazm co-stavlyaet 37-38 ° C, pH 7,8-8,0, cu excepția Ureaplasma (pH optim 6,0).
Toate micoplasmele sunt izolate într-o clasă independentă Mollicule cu o unitate - Mycoplasmatales. care este împărțită în trei familii: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae. Familia Mycoplasmataceae include două gene: Mycoplasma și Ureaplasma. Familia Acholeoplasmataceae are un singur gen - Acholeoplasma. Familia Spiroplasmataceae este reprezentată de un singur gen - Spiroplasma.
Schema de cercetare bacteriologică în diagnostic
mycoplasmoses
Materialul este luat în stadiile incipiente ale manifestării clinice a bolii, din cadavrele animalelor, nu mai târziu de 2-3 ore de la moarte, cu respectarea maximă a sterilității și transportate într-un termos cu gheață. Izolarea micoplasmei este cea mai probabilă dacă semănatul pe medii nutritive se efectuează în primele cinci ore de la luarea materialului. Pentru depozitare timp de 2-3 zile, materialul este înghețat la -20 ° C, pentru o perioadă mai lungă - la -70 ° C sau introdus în azot lichid. Materialul luat de tampoane trebuie plasat într-un mediu de transport pentru micoplasme. Atunci când se transportă probe de lapte de mastită, se recomandă adăugarea la aceasta a 5 μg / ml de ampicilină.
Detectarea microscopică directă a micoplasmelor în preparatele colorate din materialul studiat datorită polimorfismului, percepția slabă a coloranților și fragilitatea celulelor are o valoare mică de diagnostic. Detectarea și identificarea mai eficientă a micoplasmelor cu ajutorul metodei anticorpilor fluorescenți, ELISA, PCR.
Pentru a izola micoplasmelor materialul de cultură, de obicei, cultivate în două eprubete cu mediu nutritiv lichid și un două cutii Petri cu agar. Exudatul și lichidul fetal sunt placate pe medii fără tratament prealabil. Material Fabric și fluid intraarticulară pot cuprinde inhibitori, totuși acestea sunt diluate în mediu lichid la 10 „6 și fiecare diluție sunt incubate. Fabrics anterior th-mogeniziruyut. Omogenizarea se realizează într-o soluție tampon de fosfat sau un mediu lichid. țesut Excesiv mărunțite nu este recomandată etsya de - izolarea inhibitorilor, prepararea diluțiilor omogenatului urmărește același scop.
Suplimentele nutritive dense sunt cel mai bine turnate în vase de sticlă Petri, deoarece unele tipuri de materiale plastice inhibă creșterea micoplasmelor.
Culturi pe medii solide, au fost incubate timp de 5-14 zile în condiții aerobe și anaerobe-TION la 37-38 ° C, iar din cultura suficient de lung pentru a evita mass-media de uscare este efectuată la o umiditate relativă de aproximativ 75-80%. Cele mai bune rezultate pot fi obținute prin utilizarea vaselor de cultură cu 5-10% CO2. Tuburile de test inoculate în medii nutritive lichide sunt incubate în condiții aerobe și monitorizate zilnic pentru creștere.
Pentru a confirma creșterea micoplasmelor pe medii nutritive lichide, acestea sunt însămânțate pe un mediu nutritiv dens. Rezultatul însămânțării pe medii dense este considerat negativ în absența creșterii în decurs de 14 zile. Pe medii dense, prezența coloniilor este detectată sub o mică creștere a microscopului (x25 x 50). În absența creșterii,
8 funingine pe un mediu lichid cu un interval de cinci zile înainte de a se ajunge la o concluzie negativă. Pentru a izola ureaplasma, pasajele se fac pe suporturi speciale în fiecare zi.
Micoplasmele formează colonii destul de caracteristice pe medii dense. Centrul coloniei este întunecat, periferia este transparentă. Relief: centrul este înălțat ("bellied"), partea periferică a coloniei este netedă (sub formă de "ouă prăjite"). Partea centrală a coloniei crește în grosime mediu nutritiv, care este detectată prin îndepărtarea masei bacteriene flambat scalpel sau un mediu pos leduyuschim bucla bacteriologic sub site-studiu folosind microscopie colonie-pa.
Când se găsesc colonii similare cu coloniile de micoplasme, clonarea se efectuează pe medii fără inhibitori pentru a obține o cultură pură. Din cultura de bulion sunt preparate 10-1-1-10 diluții, fiecare dintre acestea (0,2-0,3 ml) fiind placată pe două plăci de agar de Petri. Două metode principale sunt folosite pentru a izola o cultură pură. În primul caz, blocul mediu de agar care conține o colonie este tăiat, inversat și însămânțat pe suprafața unui mediu de alimentare dens. Culturile sunt incubate timp de 48-72 ore. Procedura se repetă deja cu trei colonii izolate. În al doilea caz, blocul de agar este plasat într-un tub cu 2-3 ml dintr-un mediu nutritiv lichid, incubat
48 de ore la 37 ° C, cultura este trecută prin filtre cu membrană (diametrul porilor 0,45 μm). Filtratul este diluat cu mediu proaspăt 1:10 și 1: 100 și într-o buclă bacteriologică din fiecare diluție sunt însămânțate pe mediul de agar. Pro-tseduru repetând de trei ori cu mai multe colonii, tk. nu toate coloniile dau o creștere bună.
Sub influența inhibitorilor incluși în compoziția mediilor de cultură pentru cultivarea primară a micoplasmelor, este posibilă transformarea L a contaminanților bacterieni, care necesită diferențierea coloniilor
L-forme de bacterii și micoplasme.
Coloniile formelor L ale bacteriilor au o morfologie similară, dar sunt mai puțin transparente și au o structură granulară pronunțată.
Pentru o diferențiere mai precisă a Mycoplasma bacteriene formele L-pro plaguing semănat colonii pe agar nutritiv sau mediu lichid, fără penicilină și acetat de taliu. Culturile se incubează timp de cinci zile, scanând periodic colonii pe agar și celule bacteriene tipice într-un mediu lichid. Prezenta lor indică o re-versiune a formei L în starea inițială.
În plus, coloniile de micoplasme și L-forme ale bacteriilor sunt diferențiate prin colorarea cu metoda Dines. Pentru acest bloc agar excizat cu Dines colonii studiate aplicat câteva picături de colorant (metilen albastru - 2,4 g, maltoză - 10 g, azuriu II - 1,25 g de clorură de sodiu - 0,25 g, apă distilată - 100 ml) pentru câteva minute, spălați unitatea cu apă și examinați. Inițial, toate coloniile sunt vopsite în albastru, dar după cincisprezece minute, colonia de bacterii, spre deosebire de micoplasmele, este decolorată prin reducerea albastrului de metilen. De asemenea, se ia în considerare faptul că coloniile de bacterii normale pot fi spălate atunci când sunt colorate, iar micoplasmele nu sunt.
Pentru determinarea proprietăților morfologice și tinctoriale celulelor mycoplasma sunt preparate pe lame de sticlă imprimate colonii bulion de cultură preț-trifugiruyut tys.g la 10-15 și precipitatul se spală baie de apă o dată DISTILATĂ și pregătește frotiuri. Preparatele sunt fixate cu metanol, acetonă și colorate de vopseaua Gram și Romanovsky-Giemsa (1:10) timp de 3-4 ore. Mycoplasma Gram pata negativa Ro-Ekman-Giemsa Mycoplasma aholeplazmy - în lumina violet, Ureaplasma - culoare rosu-violet.
Culturile Mycoplasma în timpul funcționării este menținută prin subcultivarea pe medii lichide cu nutrienți, cu intervale de 2-3 săptămâni și depozitate la 4-5 ° C agar cultură depozitată înghețată în formă de blocuri de agaroză cu rovyh-30 -------- - 40 ° C.
Identificarea generică izolat culturi pure de micoplasma (genuri Mycoplasma, Ureaplsma, Acholeplasma) transportate de chuvstvitelnos whith la digitonină și activitatea ureazei cu diametrul microcolonii de schema prezentată mai jos.
Identificarea specifică a micoplasmelor se realizează prin studierea suplimentară a caracteristicilor suplimentare, a activității enzimatice. Metodele serologice de identificare a micoplasmelor sunt utilizate în diferite stadii ale cercetării bacteriologice. Când se diagnostichează unele micoplasmoză, se practică un test biologic și un diagnostic serologic.
Principalele metode de cercetare folosite în identificarea micoplasmei sunt prezentate mai jos.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: