Determinarea concentrației de acizi nucleici și puritatea preparatului

Metoda pentru determinarea concentrației de acizi nucleici (ADN sau ARN) într-o soluție se bazează pe existența unui maxim de absorbție la ADN și ARN la o lungime de undă de 260 nm.





Aceasta înseamnă că în soluțiile de acid nucleic se observă o absorbție fotometrică maximă la 260 nm și se corelează direct cu concentrația de ADN sau ARN.

Determinarea purității preparării ADN sau ARN

Raportul de absorbție la lungimi de undă de 260 nm și 280 nm (260 nm / 280 nm) arată puritatea preparării ADN sau ARN. Medicamentul este considerat pur dacă raportul valorilor de 260nm / 280nm este de aproximativ 1,8 pentru ADN și 2,8 pentru ARN. În cazul unor valori mai mici de 260nm / 280nm, preparatul conține o cantitate mare de impurități de proteine, fenol sau alți agenți contaminanți care au o absorbție semnificativă la 280 nm.







O altă măsură a purității preparării ADN sau ARN este raportul dintre valorile de absorbție de 260nm / 230nm. În cazul unui medicament pur, acest raport este de obicei de 1,8 - 2,2. Valorile mai mici ale coeficientului de 260nm / 230nm indică contaminarea preparatului cu componente care rămân după procedura de izolare a ADN sau ARN.

Determinarea concentrației de acizi nucleici și puritatea preparatului

Metoda de determinare a concentrației de ADN și ARN în soluție: figura prezintă spectrul de absorbție a soluției ADN în apă cu un maxim la 260 nm

Concentrația preparatului ADN este de 3,6 μg / pl. Cuvă cu lungimea căii optice de 1 mm, volum - 200 μl

Raportul de absorbție la lungimi de undă de 260 nm și 280 nm (coeficient 260nm / 280nm) este egal cu 1,73, ceea ce indică o puritate relativ ridicată a preparării ADN

Spectrul de absorbție este obținut ca rezultat al medierii automate (software) a rezultatelor a 30 de măsurători cu o durată de 10 ms

Determinarea concentrației de acizi nucleici și puritatea preparatului pot fi efectuate în cuve de volum de 200 pl (lungime optică de 1 mm) sau 1000 pl (lungimea căii optice 10 mm)

Este posibil să se construiască forme de raport cu grafice de spectru de absorbție și valori de absorbție la o anumită lungime de undă pentru 12 probe pe un singur semifabricat

Valorile spectrului de absorbție totală pot fi convertite în format MS Exel

Când se efectuează măsurarea, proba ADN se diluează de 40 de ori cu apă distilată (195 pl de apă se adaugă la 5 pl de soluție ADN). Măsurarea absorbanței la 260 nm se efectuează într-o cuvă cu lungimea căii optice de 1 mm utilizând apa ca referință. Valoarea concentrației ADN în soluția inițială (μg / μl) se găsește prin înmulțirea valorii absorbanței la o lungime de undă de 260 nm cu K = 20.

ARN se diluează de 10 ori cu apă (180 pl de apă se adaugă la o soluție de ADN de 20 pl). Măsurarea absorbanței la 260 nm se efectuează într-o cuvă cu lungimea căii optice de 1 mm utilizând apa ca referință. Concentrația de ARN în soluția inițială (μg / μl) se găsește prin înmulțirea valorii absorbanței la o lungime de undă de 260 nm cu K = 4.







Trimiteți-le prietenilor: