Colorarea micropreparatelor
Majoritatea vopselelor utilizate în microbiologie aparțin derivaților de benzen și sunt extrași din gudron de cărbune.
Coloranți utilizate în microbiologie, săruri sunt de două tipuri: 1) coloranți acizi - sunt acelea în care ion, care conferă culoare (cromofor) este un anion (de exemplu eozină); 2) principalele colorante sunt cele în care rolul cromoforului este jucat de cation (albastrul de metilen poate servi drept exemplu).
Coloranții de primul tip sunt acizi, deoarece cromoforul, fiind un acid, atunci când formează sarea care conferă culoare, se leagă de bază (NaOH).
Coloranții de tipul celui de-al doilea se numesc bazici, deoarece cromoforul, care este baza, se leagă de acidul (HCI) /
De regulă, coloranții acide se leagă mai intens cu componentele citoplasme (de bază) ale celulei, iar cele principale - cu cele nucleare (acide).
Efectul anumitor coloranți nu depinde de formarea sărurilor sau a altor compuși chimici, cu materialul fiind colorat. Ele acoperă pur și simplu suprafața, adsorbția, dizolvarea sau precipitarea în material.
În procesul de colorare, factorii fizici și chimici joacă un rol
Există metode simple și complexe pentru colorarea preparatelor microscopice.
Metode simple de colorare
Pentru o metodă simplă de colorare a micropreparațiilor, coloranții principali de anilină sunt cel mai adesea utilizați. Foarte utilizate sunt albastru de metil, magenta de bază, violet cristalin, tionină.
O metodă simplă de colorare poate fi utilizată atât pentru colorarea celulelor microbiene ucite în micropreparațiile fixate, cât și pentru colorarea pe parcursul vieții a microorganismelor.
Colorarea intravitală trebuie considerată numai astfel încât organismele colorate să rămână în viață și să fie capabile să se reproducă mult timp. Există mai multe metode de colorare intravitală, inclusiv metoda Nakanischi.
În această metodă, lamelă de sticlă curată a turnat o soluție apoasă saturată de albastru de metilen, se usucă și se șterse cu o cârpă uscată, atâta timp cât stratul de vopsea nu va lumina - umbra albastra. Pe sticla de acoperire se prepară un micoză din microbii investigați, după care medicamentul, care nu sa uscat până la capăt, este aplicat pe un diapozitiv cu un colorant. Cu ajutorul unui microscop, puteți observa cum microbii, în timp ce rămân în viață, fără a-și pierde mobilitatea activă (dacă există), devin treptat albastru.
Această metodă este valoroasă prin faptul că, atunci când este aplicată, nu există nici un pericol de formare a produselor de prelucrare artificială, în posibilitatea de a dezvălui anumite caracteristici funcționale ale celulei microbiene.
Dintre metodele simple de colorare, există atât moduri pozitive, cât și negative, de colorare.
Pentru metode simple de colorare pozitivă este colorarea conform metodei lui Lleffler și colorarea negativă prin metoda Buri.
Pentru pictura prin metoda Leffler (Loffler), puteți aplica o soluție de albastru de metilen (vopsea Leffler), care permite să dezvălui multe detalii despre forma și structura microorganismelor. Colorantul lui Leffler este un amestec de două soluții A și B.
Soluția A: albastru de metil - 0,3 g, alcool etilic - 30,0 ml.
Soluția B: KOH (0,01%) - 100ml.
Amestecul este bine conservat într-un flacon cu dop din sticlă măcinată.
Pentru a obține preparate mai curate, vopseaua poate fi turnată pe o frotiu acoperită cu hârtie de filtru sau se folosește hârtie de filtru pre-impregnată cu un colorant și uscată. În acest caz, frotiu fix strip suprapusă krasilelem dry impregnat de hârtie de filtru și apoi aplicat pe hârtia pipetează este presată mai multe apă distilată și o spatulă sau forceps pe hârtie de filtru de sticlă. Vopseaua este spălată din hârtie și petează frotiul. La sfârșitul timpului de colorare, hârtia de filtru este îndepărtată, preparatul este spălat ușor cu un curent de apă, uscat și microscopat.
Într-un preparat bine colorat și bine spălat, câmpul vizual rămâne luminos și pur și numai celulele microbiene vor fi colorate.
În plus față de metodele pozitive de colorare, în unele cazuri sunt folosite metode negative (contrastante). În acest caz, microorganismele, în care colorantul nu penetrează, arata ca particule de lumină pe un fundal uniform colorat.
Foarte frecvent pentru colorarea negativă a micropreparațiilor se utilizează cerneală neagră lichidă ("negativ" Burri).
Prin metoda Storm, fundalul preparatului este turnat cu rimel lichid. Mascara nu este o vopsea adevărată, astfel încât organismele microbilor rămân nevopsite; ducând la o imagine negativă a acestora.
În această metodă, rimelul este diluat cu apă într-un raport de 1: 9, 1: 1 sau 1: 2.
Deoarece mascara în sine poate conține bacterii, este sterilizată prin adăugarea a câteva picături de formalină sau autoclavabile timp de 30 de minute la 110 grade. Înainte de utilizare, rimelul preparat (diluat și steril) trebuie să rămână într-o stare calmă timp de două până la trei săptămâni, astfel încât particulele suspendate în acesta să fie decontate. La prepararea preparatelor de rimel, se folosește partea superioară a lichidului sedimentat.
O picătură de carcasă neagră este aplicată pe un tobogan și amestecată bine cu o picătură de suspensie microbiană. Amestecați amestecul cu un strat subțire pe suprafața culisei de marginea geamului de acoperire. Când stratul închis se usucă, medicamentul este fixat și examinat cu microscop. Celulele microbiene sunt vizibile sub formă de corpuri incolore și un fundal întunecat al preparatului.
De asemenea rimel lichid pentru colorare negativa pot fi utilizate soluții apoase kongorot (3% 0, Nigrosine (10%), iar unii coloranți negativi altă colorare colorant poate fi realizată în două moduri: fie soluția de colorant a fost aplicată pe un frotiu fix uscat, după spălare cu apă și uscare mikroskopirovat ;. o picătură de suspensie de bacterii a fost amestecat cu colorant și acoperite cu un mikroskopiruyut coverslip. și, de fapt, în ambele cazuri, celulele microbiene sunt incolore.
Metode complexe de colorare
O metodă simplă de colorare microorganisme pozitive sau negative metodă foarte potrivite pentru o varietate de scopuri (studiul formei și localizarea celulelor, încleiere, capsulele de detectare din celulele microbiene in frotiuri -. Amprentare a organelor unui organism infectat și așa mai departe).
Cu toate acestea, o metodă simplă de colorație nu poate diferenția microorganisme (inclusiv bacterii) similare în formă și mărime, dar care aparțin unor specii diferite, o metodă simplă de pictură nu poate detecta spori maturi și chisturi, vărsat în afara celulelor în mediu, o simplă metodă de vopsire nu permite pentru a detecta celulele cu o structură complexă și așa mai departe coajă.
Din acest motiv, metodele complexe de colorare sunt de mare valoare, permițându-le să se înțeleagă nu numai forma, dimensiunea, localizarea celulelor relativ una de cealaltă, diferențierea microbilor și determinarea detaliilor structurale ale celulelor microbiene.
Printre cele mai sofisticate metode de culoare valoare reprezintă un procedeu de vopsire a oamenilor de stiinta danezi dezvoltat Gram care permite microorganismelor să se diferențieze în două grupuri mari numite „Gram-pozitive“ și „Gram-negativ“, care este de mare valoare în identificarea microorganismelor.
Această metodă de colorare se numește colorare diferențială. Baza diferențierii microbilor în funcție de Gram este proprietatea membranei celulare și a membranei citoplasmatice.
Baza peretelui celular al microorganismelor gram-pozitive și gram-negative este peptidoglicanul. Gram-pozitiv microbii peptidoglican are mai multe straturi, în microbii gram-negativi este un singur strat.
bacterii gram-pozitive, are un peptidoglican dens și mai multe straturi, complexul format atunci când colorate cu cristal violet și prelucrarea ulterioară a soluției de iod nu se spală cu alcool, iar celulele nu sunt decolorate și păstrează culoarea violet. In timp ce bacteriile gram-negative, având un strat subțire de peptidoglican, decolorată cu alcool. Cu magenta culoare suplimentară sau celule gram negative sapraninom sunt colorate în sirenevato - roșu.
Microorganismele care păstrează colorarea sunt denumite "Gram-pozitive" și sunt desemnate "G +" și decolorate - "Gram-negative" și denumite "G-".
Indicatori de diferențiere a microorganismelor gram-pozitive și gram-negative:
Microorganismele gram-pozitive nu sunt sensibile la acțiunea sucului gastric, ele nu au structură complexă. Rezistent la alcalii, sensibil la lizozim, penicilină, iod. Proprietățile imunogenice sunt slab exprimate, creșterea optimă la un pH relativ ridicat. Într-o stare vie, ele sunt mai permeabile la coloranți, sensibili la electroliți. Acestea pot fi acide rapid și pot forma spori. Ei au peptidoglican multistrat și pot conține acizi teichoici. Peretele celular este poros, conține puține proteine, peptidele sunt monotone în compoziția aminoacizilor. Lipidele sunt puține, multe glicoproteine (99%).
Microorganismele gram-negative se dizolvă în majoritatea cazurilor sub acțiunea sucului gastric, se dizolvă în soluție KOH 1%, sunt sensibile la acizi. Sensibilitate scăzută la lizozim, penicilină, iod. Proprietățile imunogenice sunt bine pronunțate. Creștere optimă la pH scăzut al mediului. Într-o stare de viață, ele sunt puțin permeabile la coloranții de anilină. Rezistent la electroliții slabi, nu formează spori. Baza peretelui celular este un peptidoglican cu un singur strat, absent este acidul teichoic. Peretele celular este slab poros, are o structură complexă, conține toți aminoacizii. Lipidele sunt multe (până la 22%), glicoproteinele sunt puține (5 - 9%).
Soluții de colorare conform metodei Gramm:
1. Soluția A - violet cristalin - 2,0 g, alcool etilic 95% - 20,0 ml.
2. Soluția B - oxalat de amoniu 0,8 g, apă distilată - 80,0 ml.
Soluția A este diluată cu apă distilată (1: 5) și apoi amestecată cu un volum egal de soluție B.
3. Soluția Lugol - iod cristalin - 1 g, iodură de potasiu - 2,5 g, apă distilată - 80,0 ml. Acest amestec este lăsat timp de 24 de ore pentru a dizolva iodul.
4. Soluție pentru colorarea suplimentară - sapranină sau magenta (soluție 2,5% în alcool 95%) - 25 ml. Apă distilată - 75ml.
Metoda de colorare conform metodei Gram:
1. Fixați un frotiu care conține celule microbiene, pete cu gentianviolet (2 minute).
2. Scurgeți violetul de gențiană, apoi aplicați soluția Lugol (2 minute) la preparat.
3. Se toarnă cu grijă soluție Lugol și se spală formulare de alcool etilic 95% (30 secunde Celulele cu peptidoglican cu mai multe straturi colorate rămân violet de gențiană, un singur strat de peptidoglican -. Decolorat).
4. Clătiți cu atenție cu apă.
5. Îndepărtați frotiul cu o soluție de fucsin sau sapranină (1-2 minute).
6. Clătiți ușor preparatul cu un curent de apă, uscați-l în aer la temperatura camerei sau într-un curent de aer cald deasupra flăcării arzătorului sau blocați ușor cu hârtie de filtru.
7. Studiați medicamentul cu un microscop.
Prin diferențial complex - metode de diagnostic includ pictură și colorare și prin metoda Ziehl - Nielsen (Ziehl - Naelsen), care permite să se distingă acid microorganismele rezistente de celelalte, nu au această proprietate.
Prepararea și colorarea micoproteinei în conformitate cu Tsil - Nielsen se efectuează după cum urmează:
1. Pregătiți în mod obișnuit un frotiu fix din materialul de testare (spută sau cultura pură a pacientului).
2. Așezați o hârtie de filtru pe o frotiu fix și turnați o soluție de fuchsină carbolică pe ea. Sticla obiectului este fixată în Corne Forceps și preparatul este încălzit timp de 4 minute peste flacăra arzătorului (pe măsură ce lichidul se evaporă, se adaugă soluția de colorant).
3. După 4 minute (la capătul cald) hârtie de filtru îndepărtat cu atenție cu un preparat frotiu și 30 de secunde pentru a aplica 5 - 10% soluție de acid sulfuric sau acid clorhidric preparat în alcool etilic 95%.
4. După 30 de secunde, preparatul este spălat cu grijă cu un jet de apă rece și în plus colorat cu o soluție de albastru de metilen.
Mecanismul microorganismelor colorare acide prin Ziehl - Neelsen fi explicată după cum urmează: în timp ce încălzirea preparatul de ceară, o parte a carcasei este înmuiată și astfel vopseaua pătrunde în celula bacteriană. Răcirea, această ceară păstrează colorantul, deci alcoolul, cu acid, clătește vopseaua numai din celulele care nu prezintă rezistență la acid. Cu o culoare suplimentară de albastru de metilen, celulele decolorate sunt colorate și pe acest fundal albastru, bacteriile acide rapide colorate în roșu vor fi clar vizibile.
Vopsele pentru vopsire în conformitate cu Tsil-Nielsen:
1. Soluția A - fuchsină de bază - 0,3 g, alcool etilic 95% - 10,0 ml.
2. Soluția B - fenol (cristale topite) - 5,0 g, apă distilată - 95 ml.
3. O soluție de albastru de metil de Leffler sau verde diamant.
Soluțiile A și B sunt amestecate (fuchsină carbolică). Amestecul este bine conservat.
În practică, atunci când se studiază accidente vasculare cerebrale microscopice - printuri de organe, frotiuri de sânge, în studiul spirochete, protozoare, chlamydia, culturile de țesut sunt utilizate pe scară largă o altă metodă de colorare complexă - pata Romanovsky - Giemsa.
Metoda de pictură conform lui Romanovsky - Giemsa:
1. Medicamentul este uscat, fixat într-un fixer lichid (metanol 3 - 5 minute).
2. Preparatul se usucă și se pune într-o ceașcă cu o soluție de lucru a vopselei (expunerea este de 20-25 minute la 37 de grade, concentrația soluției de vopsea și expunerea trebuie titrată). Frotiul reprodus este diferențiat cu alcool etilic (50-60 grade), clătit ușor cu apă, uscat și microscopat.
Soluții de coloranți pentru vopsire în conformitate cu Romanovsky - Giemsa:
1. Varianta A. Se prepară o soluție - 3,8 g vopsea uscată constând dintr-un amestec de eozină și albastru de metilen, dizolvat în 250 ml de alcool metilic sau etil pur. Soluția este lăsată timp de câteva zile, adesea tremurând pentru o mai bună dizolvare a vopselei. Apoi adăugați 250 ml de glicerină pură și lăsați timp de 3 - 5 zile să se agită adesea. Soluția rezultată - vopseaua Romanovsky - Giemsa.
Înainte de utilizare, vopseaua este titrată în diluții de 1: 1, 1: 2, 1: 3, etc. preparat în apă distilată timp de 20-25 minute.
2. Opțiunea B. Aplicați culoarea azur-eozinei.
a) Se dizolvă 1 g de vopsea uscată Romanovsky - Giemsa (azur și albastru de metilen) într - un litru de apă distilată.
b) Se dizolvă 1 g de eozină într-un litru de apă distilată.
Aceste două soluții sunt depozitate separat într-un loc închis în recipiente din sticlă cu dopuri din sticlă măcinată.
Pentru colorarea preparatelor ex tempore, se prepară o soluție de lucru:
10 ml de apă distilată
4 ml de soluție de eozină
8 ml soluție de vopsea Romanovsky
O condiție prealabilă pentru obținerea unei bune culori a preparatelor este calitatea apei (pH-ul apei trebuie să fie neutru).
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: