Izolarea ADN-ului din sânge,

  1. obțineți sânge din vena unui voluntar;
  2. se adaugă 0,5 M EDTA la 50 mM => 1/10 V;
  3. se amestecă:

un preparat de sânge cu EDTA => 1V,
tampon 1 => 6V;

  • 0 ° C, 1-4 ore;
  • DF 1,5krpm, 4 ° C, 15 ';
  • îndepărtați supernatantul;
  • peleta nucleelor ​​este suspendată în "tampon 2" într-un volum egal cu 0,8 V din preparatul de sânge luat;
  • adăuga

    proteinază K până la 50 ug / ml,
    SDS 10% la 1%, => 1 / 10V;

  • 37 o C, ON;
  • se adaugă 3,0 M AcONa pH 7,5 până la 0,3M => 1 / 10V;
  • ușor extras cu neutru F, Ф: Х, Х (ЦФ 5krpm, NT, 10 ');
  • se precipită cu NaCI / EtOH;
  • se clătește cu EtOH 70%;
  • se dizolvă precipitatul în apă.
  • EDTA previne coagularea sângelui. În unele metode, heparina este utilizată pentru aceasta, dar este un inhibitor puternic al PCR și trece în siguranță prin întreaga procedură de purificare.
  • Triton X-100 lăsă membrana celulară, dar nu distruge nucleul. În acest stadiu, celulele sanguine sunt deschise, doar nucleele rămân din leucocite.
  • Depunerea nucleelor ​​de leucocite.
  • Prepararea unei suspensii de nuclee.
  • Protein Cleavage Prot.K.
  • Probabil un prejudiciu, de obicei, plec la noapte la 37 o C și pentru câteva ore la 50 o C.
  • După incubare la 37 o C, puteți întrerupe timp de 1-2 zile (depozitați la +4 o C).
  • Sarea este mai bine să adăugați la extracția de fenol, deoarece extracția cu fenol în tamponul cu sare scăzută poate fi asociată cu o pierdere semnificativă de ADN.
    • <





    ?php include ($ _SERVER ["DOCUMENT_ROOT"]. "/ vstavki / blokvtext2.php"); ?> Vezi și:
    / link-uri către resurse de rețea /
    • Metoda de izolare a ADN-ului pentru PCR din petele de sânge uscat a fost discutată la forum. Funcționează foarte repede, este suficient să fierbeți eșantionul în apă cu rășină Chelex-100 și să luați supernatantul. Folosit în criminalistică.

    Astăzi sarcina principală - alocarea totalul ADN-ului de la organe de șoarece (splină, măduvă scop, sânge, piele, vezica urinara) pentru a detecta ADN-ul agentului patogen în PCR. agentul cauzator este o bacterie (care nu are un perete celular) cu localizare intra- și extracelulară.

    întrebări:
    1. Este util să folosiți GITC sau este suficientă proteinază (înainte de a lucra numai cu proteinază)?
    2. Din momentul preluării organului până la înghețarea profundă (-70), durează până la 5 ore. există vreun sens în utilizarea soluțiilor fixative sau de liză? alcool, acetonă, același GITC?
    3. Sângele e tot clar pentru mine, dar pentru organe, în special cu un cadru de tesut conjunctiv destul de dur (vezica urinara), este suficientă în cazul în care concentrația uzuală de proteinază, sau ar trebui să încerce să-l crească?
    4. în protocoale, absența prezentei și absenței etapei de extracție fenol-cloroform (1: 1) este absentă. a făcut așa și așa mai departe. HZ ea nici nu a dat seama dacă are nevoie de ea. care sunt precondițiile teoretice pentru această etapă?
    5. În unele protocoale se utilizează cloroform, în altele cloroformul este alcoolul izoamilic (24: 1). există o semnificație specială în acest amestec?
    6. Nu am nevoie de proaspăt achiziționate de cloroform, hch pergon, cred?
    7. Aici, încă de mult timp am chinuit o întrebare - în soluții de liză se utilizează izotiocianat de guanidină și de ce clorura este imposibilă? Am un vas mare de clorură de guanidină. poate nu merita banii cheltuiti?

    1. Aș pune întrebarea înapoi. Cu guanidina, e mai rapid
    2. GITC și dacă este doar o detectare a agentului patogen, aruncați organul în frigider
    3. Concentrația convențională este suficientă, puteți mări timpul
    4. Dacă se utilizează proteinază, spălarea cu cloroform de fenol este obligatorie și, în orice caz, este de dorit
    5. Nu am văzut diferența
    6. este mai bine să utilizați "pentru biologie moleculară"
    7. Izotiocianat de lizeri mai bine, și în rest - nu-mi pasă

    Alcoolul izoamilic se adaugă la cloroform, astfel încât amestecul să nu sporească - asta e tot.







    Articole similare

    Pagina anterioară

    Pagina următoare

    Trimiteți-le prietenilor: