Restrictazii tip II - instrumentul principal al ingineriei genetice. Cele mai multe restricție de tip II endonucleases recunosc în mod specific tetra- ADN și secvența hexanucleotidar, și cel puțin trei dintre ele - octanucleotides. Mai scurtă secvență de oligonucleotide situsul de restricție, o restricție enzimă de recunoscut, mai frecvent apare într-o secvență aleatoare de nucleotide, în care fiecare dintre cele patru nucleotide reprezentate la aceeași frecvență (50% perechi A-T și 50% perechi de G-C). Astfel, o secvență aleatoare tetranucleotidelor apare în medie la fiecare 256 bp și hexanucleotidă - la fiecare 4096 pb. Cu toate acestea, în nucleotide ADN naturale de distribuție pot diferi în mod considerabil de accidentale. De exemplu, ADN-ul eucariot se caracterizează prin incidență scăzută a dinucleotid CpG și situsurile de restricție, respectiv, care conțin aceste dinucleotides (enzimă de restricție HhaI. HpaII. Taqi. Tailandez. Aval. Hae. Hindll. Sall. Sma. Xhol. Xmal). Pentru cromozomi bacterii termofile, în contrast, tind să (deși nu în toate cazurile) de îmbogățire prin perechile G-C.
Pentru cele mai multe site-uri, ușor de recunoscut de tip II de enzime de restricție, caracterizate prin prezența în ele o simetrie dublă, adică, le secvențe sunt recunoscute palindroame, de exemplu, o enzimă de restricție EcoRI - 5'-GAATTC-3“. Aceasta înseamnă că nucleotidele situate în fiecare dintre circuite la distanțe egale de axa de simetrie, complementare între ele. Dacă punctul de clivaj catene de ADN opuse sunt deplasate una față de cealaltă în situsul de restricție, care rezultă din digestia capetelor catenar de ADN unic cuprind proeminente porțiuni. Deoarece aceste domenii sunt complementare ele însele și între ele și pot interacționa unii cu alții, ele sunt adesea numite „capete lipicioase“. Capetele „lipicioase“ ale porțiunii monocatenară proeminente poate fi fie 5'- și capătul 3 '(Fig. II.1, a). indicarea formală a formării 5'- sau 3'-proeminente „lipicios“ se termină în amenajarea siturilor de restricție ale unui punct de scindare lanț ADN în secvența folosită pentru a desemna un situs de restricție, la stânga sau la dreapta axei de simetrie, respectiv. Unele puncte de restricție endonucleazică de clivaj ale ambelor catene ADN sunt situate direct sub reciproc în situsul de restricție. În acest caz, după scindarea ADN-ului „lipicios“ capetele nu sunt formate, și a obținut așa-numitele „reteza“ capete, care nu au proeminente segmente ADN mono-catenar (Fig. II.1, a). Există o diferență funcțională între 5'- și 3 'proeminente „lipicios“ se termină - nu poate ultima marca finalizarea lor de către polimeraza ADN, care ar trebui să fie luate în considerare atunci când aleg enzime de restricție pentru a produce fragmente de restricție ADN.
Deși enzimele de restricție BamHI. Bc. Bglll și XhoII să învețe diferite site-uri de restricție, ele formează aceleași capete „lipicioase“, GATC. Același lucru este valabil pentru grupul de enzime de restricție SalGI. Xhol și AvaI (NCGA). Ligaturarea fragmentelor de ADN formate prin enzime de restricție una dintre aceste grupări este unirea lor, dar site-urile de restricție sursă sunt pierdute, ca urmare, o nouă secvență continuă de nucleotide (Fig. II.1, b).
situsuri de restricție pentru unele endonucleaze de restricție de tip II nu sunt simetrice. De exemplu, o enzimă de restricție HhaI recunoaște o secvență asimetrică 5'-GACGC-3“, iar pauzele monocatenare introduse în catena opusă a ADN-ului, crestată de 5 și 10 nucleotide, respectiv. Secvențele de nucleotide ale capetelor rezultate „lipicioase“ sunt unice pentru fiecare dintre situsul de restricție. Din cauza acestei restricții fragmente de ADN formate prin acțiunea enzimei de restricție în amestec sunt conectate unul la celălalt într-o secvență inițială bine definită, care este dat o secvență unică de nucleotide într-un capete „lipicios“ ale fragmentelor de restricție ADN. De exemplu, în scindarea enzimatică de restricție formă replicativă fagul ADN fX174 14 fragmente formate care sunt combinate in vitro, în secvența corectă pentru a forma ADN-ului fX174 infectioase.
Imagine aleatorie din Baza de cunoștințe:
Atenție vă rog! Informații de pe site
www.humbio.ru este destinat exclusiv educațional
și scopuri științifice
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: