Metode pentru conservarea genei
Metoda crioconservării, metode de încetinire a creșterii
Atunci când obțineți linii celulare cu atribute utile, apare problema păstrării acestor caracteristici. Plantele pot stoca informații genetice în semințe, dar această sursă nu este complet sigură, deoarece în timp, datorită mutațiilor, germinarea semințelor scade. În plus, unele plante reproduc doar vegetativ. Aceasta necesită conservarea unei părți a materialului in vitro. Pe de altă parte, în unele cazuri, este posibil să se obțină noi linii celulare care sintetizează mai mulți metaboliți secundari, adică mai productivi, care trebuie, de asemenea, să fie păstrați.
Pentru a studia procesele fiziologice și biochimice în țesutul, standardul cere, de asemenea, cultura originală decât este cauzată de necesitatea de a păstra materialul pentru o anumită perioadă de timp, atunci când există experimente seriale. Toate acestea fac ca problema conservării genotipului să fie foarte urgentă.
Desigur, este posibilă pasivarea și transplantul de culturi celulare. Cu toate acestea, există un pericol de variabilitate somaclonală, acumulare de mutații, contaminare (contaminare cu material genetic străin). De asemenea, necesită anumite costuri financiare și de muncă (necesitatea transplanturilor frecvente, a costurilor asociate cu mediul, etc.). Scopul cercetatorilor este de a creste intervalul dintre transplanturi. Există diferite abordări privind conservarea culturilor:
- uscare (spray și liofil) - pentru celulele microorganisme.
Crioprezervarea - înghețarea la temperaturi foarte scăzute. Se efectuează de obicei în azot lichid, la o temperatură de -196 ° C.
Succesul conservării la temperaturi joase depinde de o serie de factori:
- tipul și tipul de celule,
- concentrația lor în suspensie,
- compoziția mediului de conservare,
- tipul și concentrația de crioprotector,
- modul de răcire și încălzire,
- mod de reabilitare a celulelor după încălzire.
Un rol important în blocarea cu succes a celulelor joaca starea lor morfofiziologice: celule în faza staționară de creștere, sunt mai puțin rezistente la efectul nociv al conservării la temperatură scăzută decât celulele din faza de creștere exponențială. Celulele pentru îngheț se iau în mijlocul fazei exponențiale a curbei de creștere.
La fel de importantă este densitatea suspensiei congelate. Rezultatele optime pentru repararea celulelor au fost obținute prin înghețarea unei suspensii de celule cu o densitate de 1 × 105 - 5 × 106 celule pe ml.
Pentru celulele de plante, pre-cultivarea este adesea necesară în condiții speciale. Diferite substanțe sunt adăugate în mediu, de exemplu:- 2-6% manitol sau sorbitol pentru a reduce dimensiunea vacuolelor;
- aminoacid, în primul rând prolină, care servește la legarea apei în celulă (concentrație de până la 1 mol sau 11,5%), asparagină, Acidul aminobutiric;
- dimetil sulfoxid (DMSO), care a fost adăugat la mediu pentru predkultivirovaniya o concentrație de 2,5 până la 10%, timp de 48 de ore pentru a crește permeabilitatea membranei citoplasmatice;
- în plus, se aplică călire artificiale la rece, atunci când temperatura de cultură inferioară, simulând un proces cădere naturală de pregătire pentru perioada de iarnă latența (numai pentru climatele moderate ale plantelor). Culturile culturale sunt lăsate să stea timp de câteva zile la o temperatură de +8 - +10 ° C și apoi la +2 - + 5 ° C timp de 1 până la 6 săptămâni.
Procesul de înghețare a celulelor vegetale de la animale este caracterizat, în principal, prin prezența unei etape de pre-cultivare.
Crioprotectorii sunt substanțe care reduc efectul dăunător al factorilor fizico-chimici în crioconservarea. Acestea includ zaharoză, dextran, etilenglicol, polivinilpirolidonă, dimetilsulfoxid (DMSO), glicerol. Pentru a determina toxicitatea crioprotectantului, celulele sunt ținute la temperatura camerei în diferite concentrații timp de 30 până la 50 de minute, după care se determină viabilitatea acestora. În plus, proprietățile sale de protecție sunt evaluate prin congelare și dezghețare a culturilor. Crioprotectorii cei mai frecvent utilizați sunt glicerina și DMSO. Înainte de adăugarea crioprotectorului, suspensia celulară este concentrată prin centrifugare, supernatantul este drenat. Crioprotectorii sunt introduși în cultură cu o oră înainte de îngheț, ceea ce duce la o schimbare în permeabilitatea membranei, la schimbarea punctului de îngheț și la decongelare.
Programele de răcire pot fi diferite, dar toate acestea se caracterizează printr-o rată lentă de răcire. În timpul înghețării, se formează gheață în interiorul și în exteriorul celulelor. Natura acestor modificări depinde de proba studiată și de tratamentul crioprotector, dar în principal de rata de răcire. Cu răcire lentă, formează gheața extracelulară, ceea ce duce la deshidratarea celulei înainte de atingerea punctului de îngheț al citoplasmei. Cu o răcire rapidă, celulele se îngheață rapid din interior, se deshidratează mai lent, ceea ce duce la formarea de cristale de gheață în interiorul celulei. În acest caz, celulele sunt deteriorate. De obicei, răcirea se efectuează în două etape (Figura 26):
Fig. 26. Înghețarea celulelor: a) rapid, b) lent, treptat
Etapa 1: 20--28 ° C la o rată de 1 grad pe minut (0,5 grade pentru congelare rata de celule de plante pe minut până la -35 ° C), menținut la această temperatură timp de 15 minute.
A doua etapă: imersarea în azot lichid (răcire instantanee până la -196 ° C).
Înghețarea se efectuează în aparate speciale. În lipsa acestora - baie de alcool (0,5 - 1 alcool litru se toarna in vasul termos de metal a fost scufundat în ea timp de 15 minute în fiole și se adaugă, cu agitare, azot lichid sau gheață uscată, temperatura este adusă trebuie să fie -32 ° C (temperatura nu mai mare de -28 și nu mai mică de -32 о С) Fiole suplimentare sunt transferate în azot lichid.
Când decongelare forceps fiole transferat într-o baie de apă la 37 la - 40 ° C, volumul fiolă de 1 ml de decongelate timp de 0,5 - 1 minut.
După decongelare, celulele sunt spălate fie într-un mediu de creștere (animale), fie într-un mediu de susținere. Celulele vegetative pot fi, de asemenea, spălate cu soluție de zaharoză 3-10%.
Celulele sunt apoi verificate pentru viabilitate cu ajutorul coloranților vitrimați colorați celulele moarte. Criteriul final este o reluare clară a creșterii pe mediile standard nutritive utilizate pentru o anumită cultură.
Culturile transplantate ale celulelor animale după decongelare au o sensibilitate crescută la viruși, care se manifestă în primele două pasaje. Apoi, sensibilitatea revine la cea originală.
Creșterea lentă se poate realiza prin următoarele metode:
1. Depozitarea sub un strat de ulei mineral (pentru culturile bacteriene și fungice).
2. Schimbarea compoziției gazului și a presiunii atmosferice în interiorul vasului de cultură.
3. Schimbați modul luminos.
4. Răcirea la temperatura de încetare a creșterii active.
5. Utilizarea inhibitorilor hormonali și osmotici. Dintre inhibitorii hormonali, cel mai des se utilizează clorura de clorocolină (pentru celulele plantelor), manitolul osmotic la o concentrație de 3-6%.
6. Înlocuirea CaCl2 cu Ca (NO3) 2 în mediul nutritiv.
Pentru cartofi ca o metodă care permite conservarea genei, se recomandă formarea tuberculilor în eprubete.
Alte capitole ale secțiunii:
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: