Metode de secvențiere Secvențierea ADN-ului prin metode de secvențiere moderne

Sequencing-ul este decodarea secvenței ADN.

a) secvențierea de către Sanger;

c) secvențierea generației următoare;

d) secvențiator de semiconductori.







Polimerazele utilizate în secvențarea ADN-ului:

a) fragmentul Klenow (ADN polimeraza I din E. coli) cu ADN-ul de divizare a activității exonucleazei lipsă în direcția 5'-3. Fragmentul reține activitatea polimerazei și 3'-5 'exonucleazei.

b) ADN-polimerazele recombinante care îndeplinesc următoarele condiții: - absența activității 3'- și 5'-exonucleazei,

- nu există nici o discriminare în ceea ce privește includerea în lanțul de creștere a ddNTP-urilor convenționale și modificate (etichetate).

c) Polimeraza termostabilă pentru secvențiere:

-Thermo Sequenase ™, Amersham Pharmacia Biotech

- AmpliTaq FS ™, PE Biosystems

Secvențierea de către Sanger:

1. Metoda "Plus-minus", 1975

Ca matriță într-o reacție de polimerizare, un fragment de ADN copie monocatenar a fost utilizat ca primer - oligonucleotide naturale sau sintetice subfragmente obținute prin hidroliză cu endonucleaze de restricție, precum enzima - fragmentul Klenow al ADN polimerazei I (POLI) de E. coli. Metoda a implicat doi pași. În primul rând, în condițiile reacției de polimerizare limitată a fost efectuată în prezența tuturor celor patru tipuri de dNTP (una dintre ele a fost marcat în poziția alfa fosfat) pentru a se obține un set de fragmente de produse matrice copiere incomplete. Amestecul este purificat din trifosfaților dezoxinucleozid nelegate și împărțit în opt părți. După aceea, sistemul „plus“ a fost realizată în prezența a patru reacții pentru fiecare dintre cele patru tipuri de nucleotide, și un sistem de „negativ“ - în absența fiecăreia dintre ele. Ca urmare, în sistemul de „minus“ de terminare a avut loc înainte de dNTP de acest tip, iar sistemul „plus“ - după el. Astfel obținuți opt probe au fost separate prin electroforeză, „citit“ de semnal și a determinat secvența ADN-ului original. In acest fel, ADN-ul a fost secvențiat fH174 fagul scurt constând din 5386 perechi de nucleotide.

2. Metoda Terminator, 1977

№ 22 Oamenii de știință din domeniul biologiei moleculare

Timp de 25 de ani, a condus laboratorul Cold Spring, unde a efectuat cercetări privind genetica cancerului.

În a doua jumătate a anilor 1950, Creek a încercat să determine teoretic mecanismul de sinteză a proteinelor. Până în 1958, el a enumerat caracteristicile cheie ale procesului de sinteză a proteinelor:

  • informațiile genetice sunt stocate sub formă de molecule de ADN
  • ARN matrice conține informații pentru crearea unei singure proteine
  • Moleculele adaptive (molecule de adaptor) au pus în fragmente corespondente ARN-ul matricei cu aminoacizii viitoarei proteine
  • Complexele ribonucleo-proteice catalizează asamblarea aminoacizilor într-o proteină în conformitate cu matricea ARN

Creek a introdus pentru prima dată termenul "dogma centrală" a biologiei moleculare (care este folosit astăzi) pentru a reprezenta tranziția unilaterală a informațiilor genetice prin mecanism:

ADN -> ARN -> proteine ​​("Informația este transferată de la acizi nucleici la proteine, dar nu în direcția opusă").

3. Maurice Wilkins

Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 1962 (împreună cu James Watson și Francis Crick) „pentru descoperirile lor privind structura moleculară a acizilor nucleici și semnificația acesteia pentru transferul de informații într-un material viu“. A contribuit la astfel de domenii de cunoaștere științifică, cum ar fi fosforescența, separarea izotopilor, microscopia optică și difracția cu raze X, și am îmbunătățit, de asemenea, radarul. Maurice Wilkins este cunoscut pentru activitatea sa de determinare a structurii ADN la Colegiul Regal al Universității din Londra

Direcția principală a activității științifice a fost studiul compoziției și structurii chimice a acizilor nucleici. Erwin Chargaff a determinat raportul cantitativ al bazelor azotate incluse în compoziția lor. În anii 1950-1953 sa arătat că cantitatea totală de reziduuri de adenină din fiecare moleculă de ADN este egală cu cantitatea de reziduuri de timină și cantitatea de reziduuri de guanină este cantitatea de resturi de citozină. Regulile lui Chartaff au folosit Francis Creek și James Watson pentru a determina structura ADN-ului ca o dublă helix. De asemenea, Charguff a demonstrat că ADN-ul are specificitate speciilor și a respins ipoteza existenței multor tipuri de ADN. Erwin Chargaff a fost primul care a început cercetarea denaturării ADN-ului. În plus, a studiat coagularea sângelui, a studiat lipidele și lipoproteinele și metabolismul aminoacizilor.







7. Robert Holley,
Hallley a împărtășit Premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină în 1968 cu Khar Gobind Karta și Marshall Nirenberg "pentru a descifra codul genetic și rolul său în sinteza proteinelor

Premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină în 1968 (împreună cu Robert Holly și Jar Gobind Koran) "pentru descifrarea codului genetic și a rolului său în sinteza proteinelor"

În 1960, Nirenberg, alături de J. Heinrich Mattei, a început să studieze nucleotidele. Nirenberg și Mattei în afara bacteriei au creat o moleculă ARN sintetică și au exprimat-o în E. coli

Metoda implică patru componente: segmentul de dublu helix ADN, numit ADN șablon pentru a fi copiat, doi primeri oligonucleotidici (segmente scurte de ADN mono-catenar, fiecare complementare la una dintre secvențele scurte de ADN matriță) nucleotide - blocuri chimice din care este construit molecula de ADN iar polimeraza enzima care copiază șablonul ADN prin atașarea de nucleotide libere la aceasta în secvența corectă.

Aceste ingrediente sunt încălzite, ceea ce determină dubla helix a ADN-ului șablon să se separe în spirale separate. Amestecul este răcit astfel încât primerii se leagă la capetele complementare ale segmentelor circuitelor șablonului. Apoi, polimeraza începe să copieze segmentele șablonului prin atașarea nucleotidelor la unul dintre capetele primerilor și, în cele din urmă, producerea unei helixuri dublu de ADN.

Repetarea ciclului mărește cantitatea de ADN exponențial: la fiecare 30 de cicluri, care durează doar câteva minute, rezultă mai mult de un miliard de copii ale secvenței ADN originale.

În 1960, Smith sa mutat la Institutul de Cercetare Enzimatică de la Universitatea din Wisconsin, unde a lucrat la sinteza oligoribonucleotidelor, cea mai acută problemă chimică din domeniul acizilor nucleici la vremea respectivă.

Primul care a dezvoltat o metodă de mutageneză direcționată la începutul anilor 1970 și a perfecționat-o timp de mai mulți ani. In 1978, Smith și personalul său au obținut primul succes în mutageneza direcționată a moleculelor de ADN de bacteriofag, iar în 1982 au fost în măsură să producă mari cantități de enzime, care, cu ajutorul metodei sale înlocuiește orice aminoacid selectat în secvența de aminoacizi a enzimei.

2) RAPD (aleator ADN polimorfic amplificat; fragmente de ADN amplificați) - amplificare Metoda de segmente de ADN folosind primeri aleatorii (aproximativ 10 nucleotide) nu necesită cunoștințe anterioare a secvenței ADN, dar din cauza naturii stocastică a amplificării ADN importantă optimizarea și menținerea unor condiții adecvate pentru obținerea de rezultate reproductibile . se utilizează metoda, de exemplu, pentru a studia speciile înrudite și identitatea moleculară a plantelor înmulțite in vitro [13, 14, 15]. Dezavantajele metodei sunt: ​​dominanța, nu foarte bună reproductibilitate și necesitatea ultrapurificat ADN necontaminat, deoarece utilizarea primerilor aleatorii scurte pot conduce la amplificarea fragmentelor de organisme diferite; Markerii nespecifice locus și fragmente non-omoloage de aceeași mărime (homoplasy). Din cauza RAPDs lipsa vosproizvodmiosti dificil de utilizat în studiile inter-laboratoare. Datorită importanței menționată mai sus a rezultatelor și interpretarea lor poate fi pusă la îndoială.

4) AFLP (polimorfism fragment amplificat lungime; amplificarea fragmentelor de ADN polimorfe în lungime) - amplificarea PCR selectivă Metoda fragmentelor polimorfe în lungime, care rezultă din digestia enzimatică a ADN-ului genomic cu endonucleaze de restricție. Pentru fragmentele obținute după restricția pentru amplificare selectivă, adaptoarele oligonucleotidice sunt cusute. Astfel, primerii constau dintr-un adaptor și o secvență de mai multe nucleotide (1-5), specifice pentru recunoașterea enzimei de restricție. Polimorfismul fragmentelor de-a lungul lungimii (de obicei mai multe duzini pe reacție), cauzat de un număr de situsuri de restricție genomică, este dezvăluit prin electroforeză. Reproductibilitatea și număr mare de fragmente informative în metoda de reacție poate fi utilizată în diverse aspecte: studiul identității genetice, identificarea soiurilor și clonelor relații filogenetice, cartografiere, MAS și alte implementare a metodei necesită ADN de înaltă calitate .. Deși utilizarea AFLP, cum ar fi RAPD, nu necesită cunoașterea prealabilă a secvențelor ADN, aceste tipuri de markeri sunt dificil de utilizat atunci când se studiază diferite populații sau chiar specii. Dezavantajele AFLP sunt dominarea alelelor, posibila ne-omologie a fragmentelor de lungime identice - homoplasia. În cazul inserției între situsurile de restricție adiacente, se observă pierderea unui fragment scurt și apariția unui fragment mai lung. Atunci când se utilizează markeri dominanți, de exemplu în diploide, o bandă apare în cazurile în care unul sau ambii cromozomi omologi conțin o secvență amplificabilă, i. E. Este imposibil să se facă distincția între homo- și heterozygote. Confuzia este agravată de poliploide, deoarece chiar și în cazul unei anumite bandă este chiar mai dificil de spus cât de mult alela este prezent. [22] Cu toate acestea, utilizarea markerilor AFLP în ultimul deceniu (PubMed) nu a scăzut de fapt. Metoda este folosită pentru studierea aspectelor evolutive și ecologice ale organismelor vii, păstrând în același timp speciile.







Articole similare

Pagina anterioară

Pagina următoare

Trimiteți-le prietenilor: