Crioprezervarea - stadopedie

Crioprezervarea - înghețarea la temperaturi foarte scăzute. Se efectuează de obicei în azot lichid, la o temperatură de -196 ° C.

Succesul conservării la temperaturi joase depinde de o serie de factori:







- tipul și tipul de celule,

- concentrația lor în suspensie,

- compoziția mediului de conservare,

- tipul și concentrația de crioprotector,

- modul de răcire și încălzire,

- mod de reabilitare a celulelor după încălzire.

Un rol important în blocarea cu succes a celulelor joaca starea lor morfofiziologice: celule în faza staționară de creștere, sunt mai puțin rezistente la efectul nociv al conservării la temperatură scăzută decât celulele din faza de creștere exponențială. Celulele pentru îngheț se iau în mijlocul fazei exponențiale a curbei de creștere.

La fel de importantă este densitatea suspensiei congelate. Rezultatele optime pentru repararea celulară au fost obținute prin înghețarea unei suspensii de celule cu o densitate de 1 × 105 - 5 x 106 celule pe ml.

Pentru celulele de plante, pre-cultivarea este adesea necesară în condiții speciale. Diferite substanțe sunt adăugate în mediu, de exemplu:

  • 2-6% manitol sau sorbitol pentru a reduce dimensiunea vacuolelor;
  • aminoacid, în primul rând prolină, care servește la legarea apei în celulă (concentrație de până la 1 mol sau 11,5%), asparagină, Acidul aminobutiric;
  • dimetilsulfoxid (DMSO), care se adaugă la mediul de precultură la o concentrație de 2,5 până la 10% timp de 48 de ore pentru a crește permeabilitatea membranei citoplasmatice;
  • în plus, se aplică călire artificiale la rece, atunci când temperatura de cultură inferioară, simulând un proces cădere naturală de pregătire pentru perioada de iarnă latența (numai pentru climatele moderate ale plantelor). Culturile de celule menținute câteva zile la o temperatură de 8 - 10 ° C, și apoi la 2 - 5 ° C timp de 1 - 6 săptămâni.

Procesul de înghețare a celulelor vegetale de la animale este caracterizat, în principal, prin prezența unei etape de pre-cultivare.







Crioprotectorii sunt substanțe care reduc efectul dăunător al factorilor fizico-chimici în crioconservarea. Acestea includ zaharoză, dextran, etilenglicol, polivinilpirolidonă, dimetilsulfoxid (DMSO), glicerol. Pentru a determina toxicitatea crioprotectantului, celulele sunt ținute la temperatura camerei în diferite concentrații timp de 30 până la 50 de minute, după care se determină viabilitatea lor. În plus, proprietățile sale de protecție sunt evaluate prin congelare și dezghețare a culturilor. Crioprotectorii cei mai frecvent utilizați sunt glicerina și DMSO. Înainte de adăugarea crioprotectorului, suspensia celulară este concentrată prin centrifugare, supernatantul este drenat. Crioprotectorii sunt introduși în cultură cu o oră înainte de îngheț, ceea ce duce la o schimbare în permeabilitatea membranei, la schimbarea punctului de îngheț și la decongelare.

Programele de răcire pot fi diferite, dar toate acestea se caracterizează printr-o rată lentă de răcire. În timpul înghețării, se formează gheață în interiorul și în exteriorul celulelor. Natura acestor modificări depinde de proba studiată și de tratamentul crioprotector, dar în principal de rata de răcire. Cu răcire lentă, formează gheața extracelulară, ceea ce duce la deshidratarea celulei înainte de atingerea punctului de îngheț al citoplasmei. Cu o răcire rapidă, celulele se îngheață rapid din interior, se deshidratează mai lent, ceea ce duce la formarea de cristale de gheață în interiorul celulei. În acest caz, celulele sunt deteriorate. De obicei, răcirea se efectuează în două etape (Figura 26):

Fig. 26. Înghețarea celulelor: a) rapid, b) lent, treptat

Etapa 1: 20--28 ° C la o rată de 1 grad pe minut (0,5 grade pentru congelare rata de celule de plante pe minut până la -35 ° C), menținut la această temperatură timp de 15 minute.
A doua etapă: imersarea în azot lichid (răcire instantanee până la -196 ° C).

Înghețarea se efectuează în aparate speciale. În lipsa acestora - baie de alcool (0,5 - 1 alcool litru se toarna in vasul termos de metal a fost scufundat în ea timp de 15 minute în fiole și se adaugă, cu agitare, azot lichid sau gheață uscată, temperatura este adusă trebuie să fie -32 ° C (temperatura nu mai mare de -28 și nu mai mică de -32 о С) Fiole suplimentare sunt transferate în azot lichid.

Când fiola este decongelată, penseta este transferată într-o baie de apă cu o temperatură de + 37 - + 40 о С, o fiolă cu un volum de 1 ml este decongelată timp de 0,5-1 minute.

După decongelare, celulele sunt spălate fie într-un mediu de creștere (animale), fie într-un mediu de susținere. Celulele vegetative pot fi, de asemenea, spălate cu soluție de zaharoză 3-10%.

Celulele sunt apoi verificate pentru viabilitate cu ajutorul coloranților vitrimați colorați celulele moarte. Criteriul final este o reluare clară a creșterii pe mediile standard nutritive utilizate pentru o anumită cultură.

Culturile transplantate ale celulelor animale după decongelare au o sensibilitate crescută la viruși, care se manifestă în primele două pasaje. Apoi, sensibilitatea revine la cea originală.







Articole similare

Pagina anterioară

Pagina următoare

Trimiteți-le prietenilor: