Pregătirea secțiunilor subțiri din eșantioanele țesuturilor de testare este posibilă numai după impregnarea lor cu medii suficient de dense, cum ar fi parafina și celloidina.
Parafina este un amestec de hidrocarburi cu masă moleculară ridicată obținut la distilarea petrolului. Clasele de parafină utilizate ca mediu pentru amorsarea histologică au un punct de topire de 48 ° până la 60 ° C. Cea mai convenabilă lucrare de zi cu zi este parafina cu un punct de topire de 52 ° -56 ° C. Parafinele tehnice, alimentare și medicale fără pregătire suplimentară nu permit producerea unei umpleri, ceea ce asigură o calitate superioară a secțiunilor. Laboratorul histologia este de dorit să se utilizeze un purificate de ceruri parafinice, sau prin adăugarea unui mediu pe bază de ceară, special concepute cu aditivi modificatori (Paraplast -Sigma (CSHA), Histoplast - Shandon (CSHA), Histomix - Biovitrum (Rusia).
Impregnarea cu parafină se efectuează într-un termostat, care menține temperatura la 1-2 grade deasupra punctului de topire al parafinei utilizate (de obicei este setată o temperatură de 58 ° C).
Deoarece parafina topită și etanolul nu sunt amestecate, alcoolul (sau metil salicilatul) trebuie îndepărtat din materialul deshidratat cu ajutorul unui mediu intermediar, un solvent parafinic amestecat cu etanol. Ca intermediari pot fi utilizați cloroform, benzină de aviație, eter de petrol, xilen, benzen, toluen, octan, hexan etc.
Alcoolul absolut este adecvat pentru deshidratare (ca alcool absolut) dacă rezistența sa nu este mai mică de 98 °. În practică, cel mai adesea se utilizează cloroformul. Cu disponibilitatea etanolului absolut, cloroformul ar trebui să fie preferat față de eterul petrolier mai puțin toxic, care îndepărtează mai bine etanolul și obține o calitate superioară a impregnării cu parafină.
Recomandăm următoarele scheme de cablare și impregnare a materialului.
1. Turnarea în parafină utilizând cloroform
Obiectele deshidratate sunt plasate secvențial în:
Un amestec de etanol absolut cu cloroform (1: 1) 1-2 ore
Cloroformul (I) 1h,
Cloroform (II) 1h
Cloroform (III) 1 h
Cloroform-parafină (1: 1) la 37 ° C într-un termostat 12-24 ore
Conduită prin 3 porții de parafină topită (într-un termostat la 56 ° -58 ° C) timp de 40-60 minute
2. Turnarea în parafină utilizând eter de petrol.
Obiectele deshidratate sunt plasate secvențial în:
Eterul de petrol (I) 30-60 min
Eter de petrol (II) 30-60 min
Eterul de petrol (III) 30-60 min
Eter de petrol - parafină (1: 1) la 37 ° C într-un termostat timp de 3-24 ore
Conduită prin 2 porțiuni de parafină topită (într-un termostat la 5 ° -58 ° C) timp de 60 de minute.
3. Schema de cablare a materialelor și umplerea în parafină după fixarea obiectelor în fluidul lui Buen, aplicată în cadrul Departamentului de Morfologie al Institutului de Cercetări Nucleare, RAMS
Înainte de fixare, obiectele mici, subțiri și ușor deformabile trebuie așezate pe o bucată de hârtie groasă.
Fixare în lichidul lui Buen 1 zi. (la temperatura camerei).
Clatire scurta in apa de la robinet 1-15 min.
70 ° etanol 1 zi.
80 ° etanol 1 zi. (poate fi lăsat până la o săptămână)
90 ° etanol 1 zi.
96 ° etanol 1 zi.
Etanol absolut 1 zi.
Etanol-cloroform absolut (1: 1) 2-3 ore
Cloroformul (I) 90 min
Cloroform (II) 90 min
Cloroform-parafină 1: 1 într-un cuptor de 37 °, lăsat peste noapte
Parafina 1 - 1 oră (în termostat 56-58 ° C)
Parafina 2 - 1 oră (în termostat 56-58 ° C)
Parafina 3 - 1 oră (în termostat 56-58 ° C)
calitate nesatisfăcătoare de turnare folosind cloroform se poate datora utilizării cloroform, „Spectroscopy“, care se adaugă etanol, cloroform de dozare (folosind uscat insuficient după rezervoarele de spălare) și reactiv, depozitarea pe termen lung în lumină.
Dacă nu există posibilitatea utilizării etanolului absolut, această etapă a cablajului poate fi omisă, totuși, calitatea impregnării cu parafină poate fi oarecum mai proastă. După deshidratare utilizând salicilat de metil (sau benzoat de metil), această etapă ar trebui să fie omisă. Calitatea umpluturii nu se deteriorează.
La finalul cablajului se face umplere - obiectul este plasat într-o matriță (hârtie, plastic sau metal și este umplut cu o cantitate proaspătă de încălzită la 58 ° -65 ° C parafină Dacă este necesar orientarea specifică secțiuni de țesut în felii de fabricare, folosind un ac de disecție și încălzit pensete oftalmice posibile. Rotiți materialul prin rotirea planului de tăiere la baza matriței.
Pentru a obține o consistență mai bună a blocului de parafină și pentru a oferi tăieturi de calitate superioară, are loc o răcire accelerată a obiectelor umplute. Pentru aceasta, matrițele de hârtie (sau plastic) sunt coborâte în apă rece sau plasate pe o suprafață răcită (pe o masă de răcire specială sau în compartimentul frigider la + 4 ° C).
Din parafina solidificat (de obicei, cel puțin o oră după turnare) blocuri încălzite scalpel tăiate, astfel încât parafina rămâne bucăți de margine de 1-2 mm în circumferință. În cazul pieselor dreptunghiulare care, atunci când secțiunile de fabricație trebuie să fie poziționate pe partea lungă paralelă cu lama microtom cuțit, parafină laturile scurte pot fi decupate la marginea materialului. Blocuri Pregatite folosind scalpel încălzit sau spatula speciale (spatula) a fost atașat la un blokoderzhatelyu de lemn pe care un creion, stilou sau marcator număr obiect înscriem. Poți începe să faci felii după răcirea unității.
Metalul și plasticul (din polipropilenă, polistiren etc.) trebuie încălzite în termostat înainte de turnare.
Încălzirea parafinei de turnare peste 56 ° C este recomandată în legătură cu posibilitatea de întărire rapidă a parafinei, scoasă din termostat. ceea ce duce la o umplere neuniformă a blocului cu conservarea golurilor.
Până atunci, deoarece parafina nu se solidifică, matrițele trebuie să plutească pe suprafața apei. Imersarea completă în apă, înainte ca parafina să nu fie recomandată din cauza pericolului
pătrunderea apei în interiorul blocului și crăparea și deformarea acestuia.
Răcirea pe termen lung nu este recomandată la temperaturi sub 0 ° C datorită riscului de fisuri în bloc.
Aplicarea celloidinei atunci când se toarnă în parafină
În cazul țesăturilor dense turnate în parafină, din care este dificil de realizat tăieturi de calitate și dacă este necesar să se păstreze forma obiectelor ușor deformate (de exemplu embrionii), se recomandă turnarea combinată în parafina celloidă.
Există mai multe metode, al căror scop este impregnarea inițială a țesuturilor cu soluții slabe de celloidină. Metoda dată, după părerea noastră, este cea mai de succes (în termeni de simplitate și de calitate a rezultatelor).
După deshidratare în etanol absolut (sau 96%) biți sunt transferate într-un amestec de volume egale de etanol și salicilat de metil pentru 1-24 ore (înainte de iluminare). obiectele sunt apoi transferate într-un salicilat de metil curat și lăsat timp de 12-24 h. Materialul flipper în 1-2% soluție celloidin în salicilat de metil și se lasă 3-7 zile. Se spală obiect de salicilat de metil cu eter de petrol (cloroform) și transferate în eter de petrol - parafină (parafină cloroform-37 ° C) sau direct în prima ceara de turnare. Apoi continuați să completați în conformitate cu unul dintre cuvintele recomandate.
Pentru a pregăti celloidin soluție în salicilat de metil luând 1-2 g celloidin în fulgi și a fost plasată într-un recipient etanș care poate fi închis cu 100 ml de metil salicilat, puse într-o cameră termostatică (37 ° C) timp de 2-3 săptămâni. O dată pe zi, recipientul trebuie agitat pentru a accelera dizolvarea celloidinei. Soluția preparată este un lichid sirop, limpede, ușor gălbui, care poate fi păstrat mult timp la temperatura camerei.
Trimiteți-le prietenilor: