Proteinele din soluție în corp și, respectiv, stocate într-o stare (natural) nativă datorită factorilor de rezistență, care includ sarcina moleculelor de proteină și hidratat (apa) cochilia în jurul acestuia. Eliminarea acestor factori duce la lipirea moleculelor și la precipitarea lor. Precipitarea proteinelor poate fi reversibilă și ireversibilă, în funcție de compoziția reactivilor și de condițiile de reacție. In laborator clinic de reacție practică de precipitare utilizată pentru a izola albuminei și fracțiunile globulinelor (grupuri de) proteinele plasmatice din sânge, cuantificarea caracteristicilor lor de stabilitate în plasmă, detectarea proteinelor în fluide biologice și să le elibereze pentru a obține o soluție fără proteine.
Sub influența factorilor de precipitare, proteinele precipită, dar după terminarea (îndepărtarea) acestor factori, proteinele devin din nou solubili și dobândesc proprietățile lor native. Unul dintre tipurile de precipitații reversibile ale proteinelor este sărăcia.
Principiul: Cu soluția saturată de sulfat de amoniu se precipită fracțiunea de albumin din proteine, soluția semi-saturată de sulfat de amoniu este fracția de globulină.
Esența reacției este deshidratarea (deshidratarea) a moleculelor de proteine.
Reactivi: 1) albus de ou nediluat; 2) o soluție saturată de sulfat de amoniu; 3) hidroxid de sodiu, soluție 10%; 4) sulfat de cupru, soluție 1%; 5) sulfat de amoniu în pulbere; 6) apă distilată.
Curs de determinare: 30 picături de albus de ou nediluat sunt turnate în tub și se adaugă o cantitate egală de soluție saturată de sulfat de amoniu. Conținutul tubului este amestecat. Se obține o soluție semi-saturată de sulfat de amoniu, în timp ce fracția de globulină a proteinei este precipitată și fracția albuminică rămâne în soluție. După 5 minute, precipitatul este filtrat, fracția de globulină rămâne pe filtru și fracția de albumină din filtrat. Precipitatul din filtrat este îndepărtat cu o tijă de sticlă și transferat într-un tub în care se adaugă mai multe picături de apă până când precipitatul se dizolvă. Prezența proteinei în soluție poate fi dovedită cu ajutorul unei reacții biuretice, care va fi pozitivă.
Pulberea de sulfat de amoniu este adăugată în tub cu filtrat până când soluția este complet saturată, adică până când dizolvarea sării încetează. În acest caz precipită - albuminii. Se filtrează, precipitatul din filtru se îndepărtează cu o tijă de sticlă, se dizolvă cu apă și se efectuează o reacție biuret.
Precipitarea ireversibilă a proteinelor este asociată cu tulburări profunde în structura proteinelor (secundare și terțiare) și pierderea proprietăților lor native, i. Denaturarea. Astfel de modificări în proteine pot fi cauzate de fierbere, acțiunea soluțiilor concentrate de acizi minerali și organici, săruri ale metalelor grele etc.
Reacția # 2 "Precipitarea la fierbere"
Principiu: proteinele sunt compuși termolabile și, atunci când sunt încălzite la o temperatură de peste 50-60 ° C, sunt denaturate. Esența denaturației termice este distrugerea stratului hidrat, distrugerea moleculei de proteină stabilizând legăturile și desfășurarea moleculei de proteine. Cea mai completă și rapidă precipitare are loc la punctul izoelectric (când încărcarea moleculei este zero), deoarece particulele de proteine sunt cele mai puțin stabile. Proteinele cu proprietăți acide sunt precipitate într-un mediu slab acid, iar proteinele cu proprietăți de bază sunt ușor alcaline. În soluții puternic acide sau puternic alcaline, proteina denaturată atunci când este încălzită nu precipită în precipitat. particulele sale sunt reîncărcate și poartă în primul caz un efect pozitiv, iar în cel de-al doilea - o sarcină negativă, care le sporește stabilitatea în soluție.
Reactivi: 1) albus de ou, soluție 1%; 2) soluții de acid acetic, 1% și 10%; 3) hidroxid de sodiu, soluție 10%.
Curs de determinare: în 10 tuburi numerotate, se adaugă 10 picături de soluție de ou alb. Apoi, primul tub este încălzit la fierbere, în timp ce soluția proteică devine tulbure, dar din moment ce particulele de proteină denaturată poartă o încărcătură, ele nu precipită. Acest lucru se datorează faptului că proteina din ou are proprietăți acide (punctul izoelectric al pH-ului său este de 4,8) și este încărcat negativ într-un mediu neutru. În tubul 2, adăugați o picătură de soluție de acid acetic 1% și încălziți la fierbere. Proteina precipită, deoarece soluția se apropie de punctul izoelectric și proteina își pierde încărcătura (unul dintre factorii de stabilitate a proteinei din soluție). Se adaugă 1 picătură de acid acetic 10% în tubul 3 și se încălzește la fierbere. Precipitarea nu se formează, deoarece într-un mediu puternic acid, particulele de proteine dobândesc o încărcătură pozitivă (unul dintre factorii de stabilitate ai proteinei din soluție este reținut). Se adaugă 1 picătură de soluție de hidroxid de sodiu în tubul 4 și se încălzește la fierbere. Sedimentul nu este format, deoarece în mediul alcalin crește sarcina negativă a particulelor de proteine.
Reacția №3 "Precipitarea cu săruri a metalelor grele"
Principiul: proteinele interacționează cu sărurile de plumb, cupru, mercur, argint și alte metale grele și sunt denaturate și precipitate. Cu toate acestea, cu un exces de unele săruri, se observă dizolvarea precipitatului format inițial. Aceasta se datorează acumulării de ioni metalici pe suprafața proteinei denaturate și apariția unei încărcături pozitive asupra moleculei de proteine.
Reactivi: 1) albus de ou, soluție 1%; 2) sulfat de cupru, soluție 10%; 3) acetat de plumb, soluție 5%, 4) azotat de argint, soluție 5%.
Curs de determinare: în 3 tuburi de testare numerotate, se adaugă 5 picături de soluție de ou alb. 1 picătură de sulfat de cupru este adăugată la primul tub. În tubul 2 adăugați o picătură de acetat de plumb. În tubul 3 adăugați o picătură de azotat de argint. Un precipitat este depozitat în toate epruvetele. Apoi se adaugă 10 picături de sulfat de cupru în primul tub și 10 picături de acetat de plumb sunt adăugate la al doilea tub și se observă dizolvarea precipitatului. În cel de-al treilea eprubetă, se introduc 10 picături de azotat de argint - nu se dizolvă precipitatul.
Reacția № 4 "Precipitarea cu acizi minerali concentrați"
Principiu: acizii concentrați (sulfuric, clorhidric, nitric, etc.) cauzează denaturarea proteinei datorită îndepărtării factorilor de stabilitate a proteinei în soluție (înveliș de hidrat și încărcare). Totuși, cu un exces de acizi clorhidric și sulfuric, precipitatul precipitat al proteinei denaturate se dizolvă din nou. Aparent, acest lucru are loc ca urmare a schimbului de sarcină a moleculelor de proteine și a hidrolizei parțiale. Când se adaugă acid azotic în exces, nu se dizolvă precipitatul (mecanismul exact al acestui fenomen nu este stabilit). Acesta este motivul pentru care acidul azotic este utilizat pentru a determina cantități mici de proteine în urină în laboratoarele clinice.
Reactivi: 1) albus de ou, soluție 1%; 2) acid sulfuric concentrat; 3) acid clorhidric concentrat; 4) acid nitric concentrat.
Proceedings definiții: 3 tuburi numerotate turnată în 10 picături de acizi concentrați: bază de acid sulfuric 1 tub, clorhidratul tubului 2, în al treilea tub azotic. Apoi, înclinând tubul la un unghi de 45 ° C, ușor de-a lungul peretelui tubului (astfel încât lichidul să nu se amestece), stratul 1 picătură de soluție de ou alb. Un precipitat de proteine apare la limita celor două straturi ca un inel alb. Agitați ușor tubul, și excesul de acid și apoi dizolvarea proteinei observate în eprubete cu acizii sulfuric și clorhidric, și dizolvarea proteinelor in vitro cu acid azotic are loc.
Reacția № 5 "Precipitarea cu acizi organici"
Principiu: acidul tricloracetic precipită doar proteine, iar sulfosalicilul precipită nu numai proteine, ci și polipeptide cu moleculă înaltă. Acidul sulfosalicilic (cel mai sensibil) este folosit pe scară largă pentru a detecta proteinele în urină.
Reactivi: 1) albus de ou, soluție 1%; 2) acid tricloracetic, soluție 10%; 3) acid sulfosalicilic, soluție 20%.
Curs de determinare: în 2 tuburi numerotate, se adaugă 5 picături de soluție de albus de ou. Apoi, 2 picături de acid sulfosalicilic sunt adăugate la primul tub și 2 picături de acid tricloroacetic sunt adăugate la tubul 2. În tuburile de testare a fost precipitat proteina.
Trimiteți-le prietenilor: