Trebuie avut în vedere că, atunci când culturile de celule cresc, este necesar să se excludă contaminarea lor de bacterii, ciuperci și viruși. Pentru a face acest lucru, atunci când lucrați cu ei trebuie să observați cea mai strictă sterilitate și să eliminați contaminarea virale prin utilizarea donatorilor SPF.
Culturile de celule din aceste sau alte țesuturi sau organe nu pot fi obținute cu ușurință. Dar această tehnologie necesită scrupulozitate, prudență, anumite tehnici și abilități. Celulele din țesuturi sunt eliberate prin măcinare și acțiunea tripsinei, a papainei, a colagenazei, a elastazei, a mucazei etc. Dar cea mai potrivită pentru obținerea culturilor celulare este tripsina purificată. Țesutul pulverizat este plasat foarte slab concentrat (0,25%), tripsina, care descompune substanța intercelulară care promovează diviziunea celulară. Aplicarea agitator electromagnetic, se centrifughează și spălarea repetat baza preamestec obținute suspensie celulară a celulelor vii, care este plasat în mediul adecvat. Apoi cultura celulelor este crescută într-un termostat la o temperatură de 37 ° C și după 3-4 zile se obține o cultură de celule gata. Prezența creșterii culturii celulare este determinată sub microscop. O cultură de celule în mod normal în creștere, sub microscop, va fi reprezentată de un singur strat de celule apropiate unul de celălalt și având o morfologie tipică pentru o anumită cultură. Când temperatura se schimbă, pH-ul mediului, creșterea celulelor încetinește, cultura celulară poate să moară.
Pentru a obține o cultură de celule, se utilizează așa-numitele medii de creștere care conțin proteina serică a anumitor animale, hidrolizate de lactalbumină, etc.
Timpul de generare a diferitelor culturi celulare este de 15-50 de ore. La atingerea unei creșteri bune, o reproducere mai bună a acestora încetează. O astfel de cultură de celule poate fi utilizată pentru a crește virusii în ea (Figura 2).
Fructe sau țesuturi adulte
Fig. 2. Producerea liniilor celulare în cultura in vitro
celulele somatice (conform Griffiths, JB 1989)
Aici un exemplu specific de obținere a unei culturi de celule de rinichi de viței (Fr) aplicat cultivarea tulpinii de vaccin avirulent TC-A (VIEV), virusul rinotraheitei infecțioase (RTI) la bovine. Pentru a obține o cultură de celule PT, se utilizează rinichii de la un vițel în vârstă de 1-1,5 luni. Din rinichi scoateți capsula, tăiați țesutul renal în bucăți de 3-5 mm, spălate cu grijă cu soluția Hanks cu antibiotice. Țesutul de sol este transferat într-un balon steril și umplut cu soluție de tripsină 0,25% într-un raport de 1:10 -1: 15. Dezagregarea țesutului se efectuează fracționat utilizând un agitator magnetic la o temperatură de 35-37 ° C până când țesutul este complet epuizat. Pentru a face acest lucru, petreceți 7-8 cicluri de câte 10-15 minute fiecare. Randamentul celulelor de la un gram de țesut renal este de 40-50 de milioane.
Pentru creșterea celulelor PT, se utilizează un mediu de creștere din hidrolizat de lactoalbumină suplimentat cu 10% din serul normal de sânge bovin. În acest mediu, se obține o doză de PT de însămânțare la o concentrație de 600-800 mii celule / ml. Cultivarea celulelor PT se efectuează în saltele la o temperatură de 37 ° C. Monostratul celulelor se formează în a 5-a zi. Mediul de creștere se schimbă în ziua a 2-a și a 3-a. Controlul calității culturii este efectuat macro și microscopic.
După formarea celulelor de cultură monostrat au fost spălate de două ori cu soluție Hanks, eliminând astfel proteina din zer previne replicarea virală după ce-l în cultura celulară.
În prezent, toate culturile celulare utilizate pentru a crește și a acumula virusuri pot fi împărțite în următoarele grupuri principale:
- cultura primară este o cultură celulară pentru care se utilizează celule, organe sau țesuturi luate direct din corp;
- subcultură - celule "cultura primară" subcultură;
- linia celulară - o cultură celulară derivată dintr-o subcultură;
- o linie celulară diploidă este o linie celulară, din care 75% are un cariotip tipic al celulei normale a organismului din care sunt izolate;
- transplantat (stabil) celule de linie - cultura de celule nemuritoare diploide, care au ca rezultat transformarea dobândit capacitatea unui număr nelimitat de treceri (cel puțin 70 de ori, la intervale de 3 zile);
- linia de celule heteroploide - o linie celulară care conține mai puțin de 75%) de celule diploide. Astfel de celule nu au semne de neoplasm. În același timp, ei nu au limitări în capacitatea lor de a crește în vitro.
În funcție de frecvența utilizării culturilor celulare, ele sunt împărțite în primar (periodic) și transpuse (permanent). Primele sunt folosite, de regulă, odată, adică sunt folosite o singură dată în procesul tehnologic. Acestea din urmă sunt linii celulare continue, constante, care sunt utilizate în mod repetat în procesul tehnologic.
Celulele subcultivate și apoi devenind linie de celule permanente au fost de succes, atunci când cultura monostrat primară a fost preparată prin inocularea slam tripsinizează celule frezate mecanic.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: