Metode pentru donarea ADN-ului
Biblioteci genomice, clonarea ADN in vivo
După ce ADN-ul este cusut într-un tub de testare, acesta trebuie multiplicat.
Există două abordări ale clonării ADN-ului. Prima abordare implică utilizarea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru a multiplica ADN-ul străin introdus în ele. A doua metodă este amplificarea ADN in vitro.
Clonarea ADN-ului in vivo
Folosind microorganisme, este posibil să se creeze două tipuri de biblioteci ADN: genomice și clone (cADN).
Biblioteca genomică. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Trebuie remarcat faptul că este mai bine să se folosească fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.
Molecula circulară ADN purificată este digerată cu o enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este tratat cu aceeași enzimă de restricție, adăugată la plasmidă, se adaugă ligaze. Astfel, se obține un ADN plasmidic recombinant, care este introdus în celule bacteriene sau de drojdie. Plasmidul replică cu formarea multor copii. Multe plasmide poartă o genă pentru rezistența la antibiotice și dacă există o astfel de genă într-o plasmidă recombinantă, atunci celulele pot fi ușor detectate prin creșterea pe un mediu antibiotic.
Fiecare astfel de colonie este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide poate fi numit o bibliotecă de ADN genomic. Dezavantajul acestei metode este că fragmentele ADN se formează într-o cantitate enormă. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.
CDNA bibliotecă. Crearea ADNc începe cu sinteza pe template-ul ARN folosind transcriptaza inversă a catenei complementare a ADN-ului. Se creează apoi condiții alcaline, lanțul ARN este defalcat în nucleotide, după care se sintetizează o lanț ADN complementar utilizând ADN polimeraza. În același timp, se formează un fragment ADN cu capete bont. Un astfel de ADN este inserat în plasmide și introdus în celulele bacteriene. Când se amplifică plasmida, se formează o clonă a unei copii complementare a ADN (cADN).
Avantajele ADN-ului clonat în fața clonelor de ADN genomic sunt că proteina care codifică secvența nucleotidică a genei nu este întreruptă.
Grupele geniene conțin introni care trebuie să fie îndepărtați din ARN-ul transcripției înainte de a-l converti într-un matrice ARN urmat de splicing. Celulele bacteriene nu pot efectua o astfel de modificare a ARN, formată prin transcrierea genei unei celule eucariote. Prin urmare, dacă se dorește obținerea de proteine prin exprimarea unei gene clonate, este mai bine să se utilizeze o bancă cADN derivată din ARN matriceal.
Alte capitole ale secțiunii:
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: