Clonarea prin sărituri. Crearea și screening-ul bibliotecilor de gene.
Metoda de clonare înseamnă „saltul de pe cromozomul,“ ne permite identificarea zonelor care sunt separate unele de altele prin sute de mii de nucleotide nu sunt izolate secvență intermediară. Pentru a crea o bibliotecă de gene de „sarind cromozom“ hold restricție redkoschepyaschey digerat ADN genomic (de obicei, cele mai convenabile de enzime de restricție, care sunt la o distanță de aproximativ 200 lungime kbp de salt). Aceste fragmente sunt reticulate cu o gena marcantă mică, de obicei cu gena supF (lungime = 7 kb) a fagului X, ceea ce duce la ciclizarea fragmentului. Ca rezultat, regiunile finale inițial la o distanță de câteva sute de kb. sunt îndepărtate unul de celălalt numai prin lungimea genei marker. Tratarea moleculelor inelului cu o enzimă de restricție cu mediu de legare (cel mai adesea utilizând EcoR1), sunt selectate fragmente de lungime aproximativ 20 kb. printre care și conținând gena marker și flancând secvențele sale. Când sunt inserate într-un vector, numai secvențele care conțin această genă vor fi amplificate în celulele gazdă ale genei markerului negativ.
Apoi, clona este identificată prin hibridizare cu o probă ADN. specific secvenței inițiale. La subclonarea ulterioară, se obțin două subclone în vectorul plasmidic. Un subclonă hibridizează cu o sondă de ADN specific pentru secvența originală, a doua - nu hibridizează cu această probă de ADN conține un fragment ADN distanțat de la începutul moleculei originale pentru a sari lungime.
După crearea bibliotecilor genomice. conținând fragmente mari de ADN și construind hărți ale contigului, metodele de "mers pe jos" și "sărituri peste cromozom" și-au pierdut relevanța.
Biblioteci de gene și screening-ul lor. Bazându-se pe tehnologia clonării, care permite detectarea unui fragment specific de ADN și obținerea acestuia în cantitatea necesară, au fost construite biblioteci de gene care servesc drept sursă de diferite fragmente de ADN. Gene Library - un set complet de suprapunere fragmente ADN donate care rezultă din digestia sau tăierea mecanică a moleculei de ADN originale, derivate din orice material biologic (țesut, culturi de celule, cromozomi individuali sau fragmente din ea). Numărul de clone diferite sau capacitatea de informare a bibliotecii depinde de dimensiunea ADN-ului original (genomul) și de prezența obligatorie a fiecărui fragment în cel puțin o clonă. Dimensiunea optimă a suprapunerii fragmentelor de clonare pentru a crea o bibliotecă de gene trebuie să se potrivească cu dimensiunea medie a genei speciei sau tipurile de organisme vii (mamifere - 15-25 kb) pentru care este creat.
Biblioteca poate conține toate ADN-ul genomic al acestei specii (exoni, introni și regiuni intergenice) sau numai secvențe de codificare.
Biblioteca. create pe baza ADN-ului genomic total și incluzând exonii, intronurile și regiunile intergenice sunt numite genomice. Capacitatea de informare a bibliotecilor genomice ale mamiferelor este de cel puțin 8 * 105-106. Fragmente de dimensiune optimă din ADN genomic uman sunt obținute prin restricție cu endonucleaze de restricție a frecvenței Say 3A sau Mbol.
Bibliotecile cADN constau doar din exoni. Acestea sunt construite din ADNc obținut prin transcripția inversă a ARNm, care este izolat dintr-un material biologic care exprimă genele studiate. Există biblioteci de cADN ex-presat și cADN selectiv.
Primirea ADN / ADNc. este tăiat în bucăți cu lungimea de care depinde de vectorul de donare selectat, și sistemul de vector construit, în funcție de vectorul de donare ales distinge YAC-, BAC (cromozomi artificiali bacterieni) - si PAC (plasmid cromozomi artificiali) Biblioteca conținând fragmente mari de ADN persoană. Fagilor și comidiali biblioteci de gene cele mai potrivite pentru stocarea unor cantități mari de ADN himeric. Pentru a crea o bibliotecă de gene este în principal de fagi folosit, cosmidian și YAC-sistem. biblioteci YAC-gena reprezintă fragmente de ADN genomic uman de până la 1 milion n, n. „Cusută“ cu regiunile de drojdie centromerică de cromozomi. După identificare, biblioteca clona porțiunea YAC-guseu dorită poate fi subclonată în fagi sau cosmidă biblioteci. Cel mai convenabil biblioteca gena umană a fost construită folosind vectori de donare bazată pe fag X - EMBL3 și EMBL4. Acest lucru se datorează caracteristicilor vectorilor:. Intervalul de capacitate de ambalare - 9-23 kb; numărul mare de site-uri de donare convenabile (care permite utilizarea diferitelor enzime de restricție în pregătirea pentru inserarea fragmentelor de ADN); Secvențele pBR322 lipsesc și plasmide ColE1, cel mai des folosite pentru clonare (care permite selectarea clonelor dorite folosind ADN fagic, netăierea insert).
Skriniruya biblioteca de gene. este cautat secvențe ADN relevante metoda de screening ales depinde de caracteristicile specifice ale acestor secvențe. Pentru bibliotecile de screening utilizează în general hibridizare blot cu sonde ADN (oligonucleotide, ADN și la celălalt) sau immunnoblot cu anticorpi specifici (în cazul în care biblioteca este conceput pe baza eksprecciruyuschego vector). Screening-ul posledovatelngh presupune mai multe etape: însămânțare bibliotecă de fagi himeric pe un gazon de bacterii care se dezvoltă pe suprafața unui mediu de cultură solid în cutii Petri (fiecare placă litic de pe gazon bacteriene - infectarea celulelor rezultate de o clonă de fagi); „Reimprimați“ culturilor obținute de pe cealaltă capsula Petri în scopul dublării; transferul de creștere și colonii lizate pe filtru original, cu distrugerea simultană a membranelor celulare, ADN si proteine prin fixarea; hibridizare blot cu o sondă marcată de ADN sau imunoblot cu anticorpi marcați (pentru bibliotecile de expresie). Pasul final al screening include identificarea fagi pozitivi de colonii autoradiografice (după îndepărtarea sondelor ADN nelegate și anticorpii pete intunecate pe film cu raze X va apărea în locurile de localizare a coloniilor care conțin fragmentul complementar ADN sondă sau antigenul specific) și selectarea acestora în culturi duplicat. Pentru a evita greșelile efectuate în mod repetat de screening de colonii selectate.
În plus, pentru a obține o cantitate suficientă din fragmentul selectat pentru investigarea sau utilizarea acestuia ca probă ADN, acesta este subclonat într-un vector de plasmidă.
Recomandată de vizitatorii noștri:
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: