Biblioteci în genetica moleculară. Ce este o bibliotecă?
O bibliotecă este un set de clone, fiecare conținând o moleculă vectorică a diferitelor fragmente de ADN derivate din ADN-ul total sau ARN-ul celulelor sau țesutului. Dacă colecția de clone este suficient de mare, teoretic ar trebui să conțină întreaga secvență a ADN-ului original. Apoi, puteți identifica în bibliotecă o clonă care transportă fragmentul de ADN de interes, folosind metode sensibile de screening care o pot detecta într-o colecție de milioane de fragmente diferite numite "bibliotecă".
Biblioteci genomice. Un tip util de bibliotecă conține un set de fragmente de ADN genomic. generat cu ajutorul unei cantități deliberat limitate de enzime de restricție care taie ADN-ul la punctele adesea găsite în genom. Datorită utilizării unei cantități mici de enzime, nu toate, dar numai unele site-uri de recunoaștere a enzimelor, sunt scindate la întâmplare.
Metoda generează un set de fragmente suprapuse. adecvate pentru donarea în vectori. De exemplu, plasmidele care sunt special concepute pentru a crea un BAC, pregătit, astfel încât vectorul poate fi transferat generat în timpul fragmentelor de restricție parțiale ale ADN-ului uman variind în mărime de la 100 la 350 kilobaze. Odată plasmida recombinantă care conține fragmente mari de ADN uman făcut în biblioteca de bacterii care conțin mai multe mii de clone, fiecare conținând diferite fragmente de ADN genomic care se suprapun parțial pot fi stocate pentru izolarea ulterioară a multor gene. Dacă biblioteca este suficient de mare, fiecare segment al genomului va fi reprezentat pe cel puțin unul dintre fragmentele suprapuse.
Biblioteci de ADN complementar. Un alt tip obișnuit de bibliotecă folosit pentru a izola secvențele de gene este bibliotecile ADNc conținând copii ADN ale ARNm ale unui țesut special. Ca o sursă de clonare a genei pentru unele aplicații, secvențele ADN complementare sunt preferabile bibliotecilor genomice deoarece:
• ADNc conține numai exoni ai genei și, prin urmare, o reprezentare directă a secvenței de codificare a genei fără introni și un promotor;
• kituri cADN. copiile reprezentând o singură genă pot diferi, indicând faptul că există promotori alternativi sau puncte de poliadenilare sau diferite puncte de îmbinare, astfel încât anumiți exoni pot fi incluși sau excluși din unele copii;
• Utilizarea unei anumite surse de ARNm crește în mod semnificativ numărul de copii ale unei gene cunoscute selectiv exprimate în acest țesut.
De exemplu, câteva kilobaze de ADN. care conțin gena beta-globină, reprezintă doar o parte din milionul din biblioteca genomică umană, dar acesta este principalul transcript de mRNA din celulele eritroide. Astfel, bibliotecile cADN create din precursorii eritrocitelor sunt sursa optimă de izolare a ADNc corespunzând la ARNm (3-globină.
În mod similar, bibliotecile cADN ale ficatului sau mușchilor sunt sursa preferată de ADNc pentru clonele de gene care sunt exprimate predominant sau exclusiv în aceste țesuturi. În același timp, ADNc nu dă nici o indicație a mărimii sau numărului de exoni genei sau a secvenței de îmbinare.
Clonarea ADNc apare cu participarea ADN-polimerazei dependente de enzima revers transcriptază, obținută din retrovirusuri capabile să sintetizeze un fragment cADN monocatenar bazat pe șablonul ARN. Lanțul unic rezultat al cADN servește ca un șablon pentru ADN polimeraza care transformă molecula mono-catenară într-o helix dublu-catenar. Este utilizat într-un vector adecvat pentru a crea o bibliotecă cADN care să reprezinte toate copiile originale ale mRNA găsite în tipul inițial de celule sau țesuturi. Un ADNc reprezentând un ARNm particular în întregime este deosebit de util atunci când este necesar să se reprezinte lungimea completă a secvenței de codificare a genei.
Unele vectori dispuși în mod greu. așa numiții vectori de expresie includ semnale transcripțional și translațional conectate la punctul de inserție al ADNc, astfel încât un ADNc complet poate fi transcrisă și bacterii, drojdii sau celule de cultură care produc proteine codificate sunt traduse.
Mii de biblioteci cADN au fost create din țesuturi diferite sau din aceleași țesuturi luate în diferite stadii de dezvoltare a multor organisme. Ei au devenit o sursă neprețuită de cADN pentru o gamă largă de copii ale ARNm. Obținerea unei biblioteci mari crește șansele ca orice ARNm de interes, indiferent cât de rar, să fie prezentat cel puțin o dată în bibliotecă.
Resursele bazei de date a bibliotecii genomului
Deși construcția bibliotecilor și screening-ul acestora rămân metode importante pentru descoperirea și descrierea proprietăților genelor, Proiectul genomului uman și multe dintre aplicațiile sale au un impact semnificativ asupra cercetării geneticii umane. De exemplu, extinderea rapidă a bazelor de date accesibile pe internet care conțin informații despre secvențele de nucleotide ale genelor face ca din ce în ce mai mult să nu mai fie necesară construirea și monitorizarea bibliotecilor.
Clonele BAC sau ADN cu o anumită secvență de nucleotide de interes pot fi identificate prin software care se potrivește cu secvența căutată cu toate secvențele încărcate în bazele de date. Multe biblioteci de actualitate care conțin secvențe ordonate de clone individuale sunt stocate în depozite comerciale centralizate, din care poate fi ușor obținută orice clonă cu o secvență interesantă, găsită prin căutarea automată a bazei de date.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: