Revenind la opțiunile adevărate cromatografia, este util să se introducă conceptul de faza „mobil“ și „staționare“. Aceasta se referă la mișcarea moleculelor fracționate în jos a coloanei. Fază mobilă, desigur, cuprind molecule în afara granulelor. Ei se mișcă cu curent eluentului. Faza staționară - molecule în interiorul granulelor. O astfel de separare a avut loc, iar filtrarea pe gel. Există încă în acest sens molecule au fost cele datorate dizolvării lor într-un mediu de apă staționar umplerea granulelor. Desigur, în acest mediu, au făcut mișcare browniană, dar nu este de a le muta din difuzoare. Cu materialul se granule, dacă acestea au reacționat și apoi mecanic - se confruntă cu filamente polimerice, formând granule.
În cazul cromatografiei de schimb ionic, invers, faza staționară cuprinde în principal mod specific molecule legate de granule de material ( „sorbit“ pe ea). Porozitatea celui din urmă în acest caz este aleasă astfel încât moleculele fracționate să poată pătrunde aproape liber în granule, umplând întregul lor volum intern.
Cromatografia cu schimb de ioni cu numele foarte indică faptul că legătura dintre molecule și granule trebuie să fie ionică. Adică, forțele Coulomb determină atracția dintre ionii semnelor opuse, fixați pe filamentele granulelor și existenți pe suprafața moleculelor. Cuvintele "fix" și "existente" sugerează o situație fixă o dată pentru totdeauna. În același timp, flexibilitatea și eficiența metodei cromatografiei de schimb ionic se bazează doar pe posibilitatea de a controla situația, și cu ea conexiunea de alimentare fracționat substanță moleculară cu granule de matrice - caracterul sorbție al acestor molecule.
In loc de ion constant asupra filamentelor matricei și pe suprafața macromoleculei (de exemplu, proteine) sunt situate „grup ionic“, care, în funcție de condițiile din mediul apos înconjurător (pH, prezența sărurilor) se poate manifesta fie ca deschis purtătoare de ioni de sarcină electrică, fie neutralizată datorită abordării ionilor care poartă o încărcătură opusă, de exemplu Na + sau Ci- și uneori datorită disocierii sau adiției protonilor H +.
Pe suprafața proteinelor, grupările ionogene termină ramificațiile laterale ale aminoacizilor, cum ar fi lizina și arginina sau acizii aspartici și glutamic. Disocierea protonului în primul caz și asocierea în al doilea neutralizează aceste grupuri. Ambele procese depind de concentrația de protoni în mediul apos înconjurător, adică de valoarea pH (în domeniul alcalin sau acid, respectiv). În loc de modificări chimice, care sunt ambele aceste fenomene, neutralizarea grupărilor de sarcină ionice pot apărea datorită adaptării sale de ion încărcat oppositely, în mod corespunzător prin acțiunea forței Coulomb împotriva grupului ionic din mediu. Nu se formează o legătură chimică covalentă. Ionul de screening, în acest caz, se numește "contraion".
grupări ionice, capabile să arate sarcina lor pozitivă, denumite în continuare „schimbători de anioni“ - acestea sunt într-un mod similar cu anod într-un circuit electric. Grupul se deschide sarcinii sale negative, respectiv, denumite în continuare „schimbătorii de cationi.“ Pentru a modifica granule cromatografice filamente practica selectate un număr mic de grupe ionice de diferite „forțe“. Cele mai frecvent utilizate pentru „schimbătorii de anioni“ (cromatografie cu matrice bearing anioni) sunt: dietilenglicol Noetus - abrevierea DEAE și di-2-etil-oksipropilaminoetil abrevierea QAE. Rețineți că prima dintre aceste grupe pot fi relativ ușor neutralizate chimic într-un mediu alcalin din cauza pierderii unui proton. În al doilea rând - poartă o sarcină pozitivă la orice mediu de pH-ul și adaptarea poate fi neutralizat numai contraion încărcat negativ. În conformitate cu această distincție a schimbătorilor de anioni pe bază de DEAE denumit „slab“ și schimbătoarele bazate pe QAE - „puternic“.
În mod similar, în cazul grupărilor ionogene negative, "schimbătorii de cationi" sunt "slabi" - aceștia poartă grupări carboximetil și "puternice", care sunt modificate prin grupări sulfopropil. Abrevieri pentru aceste grupuri, respectiv SM și SP. Curenți puternici schimbătoare de cationi își păstrează încărcătura negativă în întreaga gamă biologică de lucru (pHS-11) și pot fi analizate numai prin contraioni pozitivi.
În ceea ce privește matricelor, purtătorii descrise modificări (în cazul fracționării biopolimeri), este deja cunoscut pentru noi granulele pe bază de polizaharide: Sephadex agaroză reticulată chimic și celuloză. În numele lor comercial există și numele materialului matricei și indicația abreviată a grupului ionogen. De exemplu: .. „DEAESephadex», «QAE-celuloză "" CM-Sephadex», «SP-Sepharose CL» etc. Fiecare tip oferă mai multe schimbătoarelor diferite dimensiuni ale porilor și granule.
Matrice pentru cromatografia de schimb ionic la presiune ridicată (silicagelul) las deoparte. Pharmacia Company pentru cromatografia său sistem proteic rapid dezvoltat pe baza exclusiv granule de dimensiuni uniforme, sunt două tipuri de schimbătoare de ioni puternice: schimbător de anioni sub marca „Mono P“ - grup activ trimetilaminometil kationoobmenik și „Mono S» - sulfometil grup activ.
Acum va fi util să ne imaginăm câteva relații spațiale. Ne vom concentra pe purificarea și fracționarea proteinelor, deoarece aceasta este principala zonă de utilizare a cromatografiei cu schimb de ioni. Diametrele proteinelor globulare (spre deosebire de masele lor) nu variază foarte mult. De exemplu, o moleculă de albumină serică bovină (M = 69,000) are un diametru de 70 A, și molecula de gamma-globulină (M = 150.000) aproximativ 100 A. (Având în vedere aceste figuri am menționat matrice pe bază de polistiren au rezoluție porii se află în intervalul 5-20 A.)
Porozitatea matricilor utilizate pentru fracționarea proteinelor se află în intervalul de 300-1000 A. In astfel de molecule de proteine pori se pot deplasa la fel de liber ca o minge de tenis din plasă de sârmă cu celule spațiale nervură în 30-40 cm.
Proteinele de pe grupările ionice de suprafață pot fi fie semn aminoacizi (toți - slab), distanțate la o distanță de câteva zeci de angstromi. grupe ionice în granule pot fi localizate mai îndeaproape, deoarece îmbinarea grupărilor OH poate fi efectuată în fiecare unitate de glucoză. Dar este inutil, pentru că cele două grupuri atât de strâns spațiate nu au putut, din cauza dimensiunii lor, să comunice simultan două molecule de proteine, și neprofitabile, așa cum plină cu legarea unei molecule prea puternic la mai multe puncte. Practica a dezvoltat la distanța medie dintre grupe ionice pe o singură dimensiune matrice 10--30 A.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: