CULTIVAREA VIRUSELOR - viruși în creștere în condiții artificiale prin infectarea animalelor, culturilor celulare și tisulare. K. in. produce în scopuri de diagnosticare (izolarea de la pacienți și purtători), în munca experimentală (studiul virusurilor), pentru producerea de vaccinuri și diagnosticuri virale.
Virușii sunt reproduse numai în celulele vii, deci sunt infectate cu viruși de animale sau culturi de celule și țesuturi pentru acumularea lor. În același timp, virusul obținut din organismul pacientului sau al transportatorului se adaptează la noile condiții. Cu cât sistemul artificial este diferit de cel natural, cu atât este mai ușor să adaptați virusul.
trebuie să utilizați sistemul cel mai sensibil pentru replicarea virală optimă și infecția cheltuirii diluat puternic cu material proaspăt sub formă de particule de virus inactivat poate inhiba reproducerea virionilor infecțioși. Sistemul, într-un roi-virus trece un ciclu complet de reproducere este numit permisive (permițând). La sistemul de non-permisive (non-permisive) are loc ciclu de reproducere partiala a virusului, sau el nu este reprodus. Permisivă pentru sistemul de virus poate fi non-permisiv pentru ea atunci când se schimbă condițiile de cultură, de exemplu, atunci când se schimbă temperatura.
Animal cultiva aceste virusuri care le cauzează o imagine clară a clinică sau patologiei (de ex. Dezvoltarea paralizie la soareci cu virusul de rabie infectie sau pneumonie cu infecție gripală). Mulți viruși cresc mai bine în țesuturi diferențiate slab de embrioni de păsări și mamifere nou-născuți decât la animalele adulte.
Pentru K. in. folosind șoareci, șobolani, porci de guineea, iepuri, hamsteri sirieni, dihorilor, maimuțe, pui, etc. La șoarecii adulți au fost virusul gripal cultivat, rabie, multe Togaviridae .; șoarece-ventuze sunt indispensabile pentru numărul de virusuri și arenaviruses seria Coxsackie Togaviridae în creștere - agenți patogeni ai febre hemoragice virale.
Pentru a obține rezultate standard, animalele folosite pentru a lucra cu viruși trebuie să fie omogene din punct de vedere genetic. Acest obiectiv este încrucișarea încrucișată a laboratoarelor. animale - frați și surori sau părinți și copii, atingând astfel un grad sporit de homozigozitate.
Pentru succesul K. in. în plus față de tipul și vârsta animalelor, calea de administrare a materialului este importantă, care se datorează troficității virusului. Prin urmare, în majoritatea cazurilor, pentru reproducerea virusului în corpul animalului, este necesar să se inoculeze în țesutul sensibil. Doar unii viruși sunt patogeni animalelor în orice mod de inoculare (de exemplu, virusul encefalitei de cal din Venezuela pentru șoareci).
Majoritatea virusurilor neurotropice sunt cultivate prin introducerea lor în emisfera cerebrală a animalelor. In acest fel, soarecii sunt infectati cu diferite togavirusuri, virusuri buny si alte arbovirusuri. Virusul rabiei se administrează în același mod șoarecilor, iepurilor, oilor și câinilor, iar virusul choriomeningitei limfocitare se administrează șoarecilor și cobaiilor. Când virusul poliomielitei este cultivat pe maimuțe, acesta este inoculat în măduva spinării sau în talamusul creierului. Adesea, atunci când virușii neurotropici sunt cultivate, ele sunt administrate la animale în cavitatea abdominală, dar acest mod de inoculare este inferior în sensibilitatea la intracerebrală. Virusurile respiratorii sunt cultivate de obicei prin infecție intranazală - sunt instilate într-un animal anesteziat sau injectate sub formă de aerosol într-o cameră specială.
Adenovirusurile sunt inoculați subcutanat sau hamsteri sirieni mucoase pungi obraz, maimuțe virus herpes - iepuri intradermic si virusurile variola - pe piele scarfica (iepuri, viței, pui). pox virusuri și herpes virusuri pot fi cultivate pe cornee de iepure scarificare. Introducerea de viruși în mușchi, intravenos, oral, și pe rect este rar folosit. infecție intravenoasă de cobai, hamsteri și dihorii punct de vedere tehnic dificil, în schimb, materialul cel mai adesea injectat în cavitatea inimii.
K. in. pe animale este foarte dificil pentru prezența în organism a diferitelor bacterii, micoplasme și viruși, care pot contamina virusul cultivat. Uneori, un virus din corpul animalului creează imunitate la virusul care este cultivat, de exemplu, agentul cauzator al ectromeliei la șoareci față de virusul vaccinului.
Pentru a reduce riscul de contaminare a virușilor cultivați de agenții patogeni externi, animalele crescute în izolare sunt din ce în ce mai folosite. În acest scop, se obțin animale libere de agenți patogeni specifici speciilor, SPF (fără patogen specific). Mamele lor nu ar trebui să aibă infecții transmise prin placentă. Cuburile sunt îndepărtate cu ajutorul secțiunii cezariene, sunt injectate în intestine de bacterii apatogene, de exemplu acidul lactic, după care sunt hrăniți de femele SPF. În viitor, aceste animale se înmulțesc în mod obișnuit. Acestea le conțin în spații închise, unde sunt furnizate aer steril, alimente, apă, etc.
Animalele care sunt libere de toți agenții patogeni sunt păstrate în cutii speciale, în condiții de izolare și mai strictă (a se vedea animalele sterile).
Embrioni de păsări cu țesuturi nediferențiate sunt potrivite pentru cultivarea multor virusuri. Pentru rezultate optime, un tip de valoare și vârsta embrionilor infectați calea doza administrată și temperatura de incubare. Cel mai adesea folosiți embrioni de pui. Ele sunt cele mai sensibile până la a 13-a zi de incubație. virusurile inoculate cu membrana, de obicei, chorio-alantoidian, în sacul vitelin, amniotic si cavitatea alantoidiană; in creierul de embrioni și intravenos (cochilii nave) virusurile rareori administrate. Multe togavirusuri sunt cultivate în sacul de gălbenuș; virusurile gripale și inf. Oreionul este bine cultivat in cavitatea amniotic a 10 embrioni de 11 zile vechi, virusul gripal replicate nu numai în celulele amnion, dar, de asemenea, în trahee și plămânii embrionului. pox virusuri etc. grupe. Cultivate decorticate-chorio alantoidian infectarea embrionilor 10-13 zile a prin sacul de aer natural, sau printr-o gaură în suprafața laterală a oului după crearea unui sac de aer artificial. La infecția cu embrioni pot fi rănite, astfel încât moartea lor în primele 24 de ore este considerat ca fiind nespecifice. Valoarea optimă a virusului în timpul infecției este de 1000-10 000 de doze infecțioase. K. in. în embrioni apare de obicei la t ° 36-37 °. Unii viruși, de exemplu, virusul vaccinia se pot reproduce la o temperatură de peste 40 °, în timp ce agentul cauzator de variola fi cultivate la o temperatură nu mai mare de 38,5 °. virusurile mutante sensibile la temperatură au redus, de obicei, patogenitate, cultivată la t ° 25-28 °.
În timpul multiplicarea embrionilor virusurile pot provoca moartea lor (mulți arbovirusuri, virusul encefalomiocarditei etc.), Apariția modificărilor în membrana (virusul variolei)-chorio alantoidian sau în corpul embrionului, acumularea în fluidele fetale hemaglutinina (virusurile gripale, oreion) și complement de virus antigen.
Majoritatea virusurilor cunoscute pot fi cultivate în culturi celulare și țesuturi (a se vedea). Cel mai des se utilizează culturi celulare primare sau transplantabile cu un singur strat pe sticlă, iar culturile de suspensie sunt utilizate mai rar. La culturile celulare primare, virusurile se adaptează mai ușor decât cele transplantate. Virusurile umane sunt cel mai bine reproduse în culturi de celule umane și celule renale de maimuțe.
Doza optimă a virusului pentru infecție este de 0,1-0,001% 50% din doza citopatică țesut a virusului per celulă. Volumul inoculului trebuie să fie redus. Adsorbția virusului se efectuează timp de 1-2 ore. la t ° 37 °, după care inoculul este îndepărtat dacă este toxic pentru celule. Mediul nutritiv ar trebui să aibă un pH de 6,9 până la 7,2. Dacă se adaugă ser, acesta din urmă nu trebuie să conțină anticorpi sau inhibitori nespecifici în ceea ce privește virusul care este cultivat. Reproducerea cea mai intensă a majorității virusurilor are loc la t 36 - 37 °; la o temperatură mai mică (33 °), rinovirusurile sunt cultivate.
Când K. in. în scopul izolării lor de organele infectate, cultivarea celulelor țesutului propriu-zis după tripsinizare (de exemplu, țesutul amigdalitar pentru izolarea adenovirusurilor) este foarte eficientă.
Reproducerea majorității virușilor este însoțită de modificări citopatice. Cantitatea maximă de virus din cultură este observată de obicei cu degenerarea a 75% din celule. Propagarea virusurilor, activitate non-citopatic, pot fi setate folosind reacția gemadsorbtsii (și multe mikso- Togaviridae), prin imunofluorescență, prin investigarea mediului de cultură pentru prezența hemaglutinina (de ex. Miksovirusy) sau antigen complement virus, și în cazul experimentelor pe animale (virusul rabie). Unii viruși pot fi identificați prin capacitatea lor de a inhiba multiplicarea virusului citopatic, adică. E. La fenomenul de interferență (de exemplu. In culturile de celule embrionare de pui infectate cu virusul leucozei aviare, nu reproduce virusul sarcomului Rous). Se formează niște viruși în celulele de includere.
Cele mai multe virusuri după propagarea în celulele în afară în mediul de cultură, o serie de alte resturi asociate cu celule (pox virusuri, adenovirusuri), unele virusuri herpes trebuie sa fie replantate cu celulele intacte, deoarece distrugerea acestea sunt celule inactivate. Uneori interacțiunea dintre virus și celulă dezvoltă infecție cron. De exemplu. infectate cu virusul choriomeningitei limfocitare, celulele umane transplantabile pot produce inf. virus pentru multe generații.
Pentru cultivarea coronavirusurilor umane și a altora, se utilizează culturi de țesut, adică fragmente de țesut cultivate în afara corpului. Țesutul cel mai frecvent utilizat este traheea unui iepure. Înmulțirea virusului în acest caz este judecată prin încetarea mișcării culturii țesuturilor cilia.
Trebuie luată în considerare posibilitatea prezenței diferiților viruși și a micoplasmelor în culturi de celule și țesuturi. Acestea pot fi introduse împreună cu celulele dacă acestea sunt luate din organismul infectat, obținute din tripsină sau utilizate ca ingredient în mediul nutritiv al serului.
Adaptarea virusului la condițiile de reproducere artificială necesită mai multe pasaje care urmează repede reciproc atunci când sunt infectate cu o mică doză de virus. De obicei, intensitatea reproducerii virusului crește semnificativ. Uneori, după adaptarea la un sistem, virusul dobândește capacitatea de a se reproduce și în alte sisteme. Virusii proaspăt izolați sunt mai plastici decât cei care se cultivă îndelung în orice condiții. K. in. în condiții artificiale duce adesea la o scădere a patogenității lor pentru gazdele naturale, care este folosit pentru a obține tulpini de vaccin. În condiții nefavorabile de cultivare (sisteme cu sensibilitate scăzută sau când o doză este prea mare) se pot forma particule virale defecte care conțin doar o parte a genomului sau care nu au un acid nucleic. Unele virusuri, în general, nu pot fi cultivate în condiții artificiale sau reproducerea lor încetează după mai multe pasaje.
Păstrați viruși timp de mai multe zile la o temperatură de 4 ° într-un mediu cu un pH de aprox. 7.0. Stabilitatea lor crește odată cu eliminarea fragmentelor de celule și adăugarea de ser (10%), glicerină (50%) sau lapte degresat (50%). Toți virușii sunt bine conservați la t ° -70 ° și mai mici în vase închise ermetic; mulți rămân viabili de luni și chiar ani. Virusurile fungice și enterovirusurile sunt bine conservate la t ° -20 °. Înghețarea virusului ar trebui să aibă loc rapid. Pentru a spori stabilitatea virusului, în mediu se adaugă proteine din zer, gălbenuș de pui, peptonă, zaharoză sau glucoză. Efectul stabilizatorilor asupra diferitelor virusuri nu este același. Virușii pot rămâne viabili pentru o lungă perioadă de timp și după liofilizare. Ca stabilizatori se utilizează peptonă (10%), lapte (50%), zaharoză cu gelatină sau gălbenuș de pui (10% fiecare). Virusul liofilizat trebuie depozitat într-un vid sau într-un gaz neutru (de exemplu, azot) la t ° 4 ° sau -15 °.
Bibliografie: Diagnosticul de laborator al bolilor virale și rickettsiale, ed. E. Lennet și N. Schmidt, per. cu engleza. M. 1974; Sokolov MI Sinitskii AA și Remezov PI Studii virologice și serologice în infecțiile virale, L. 1972; Shtarke G. și colab., Virologie practică, trans. cu el. M. 1970, bibliograf.; Diagnosticul comparativ al bolilor virale, ed. de către E. Kurstak a. C. Kurstak, v. 1-2, N. Y. a. o. 1977.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: