C12N9 / 48 - care acționează asupra legăturilor peptidice, de exemplu tromboplastină, aminopeptidază leucină (3.4)
Proprietarii brevetului RU 2280076:
Institutul Pacific de Chimie Bioorganică din Filiala Orientului de Extremă al Academiei de Științe din Rusia (RU)
Invenția se referă la un medicamente multienzimatic din materiale de origine animală marine și metode pentru prepararea acestora și pot găsi aplicații în biotehnologie, medicină, cosmetică, medicină veterinară, agricultura, cercetarea și producția de reactivi biochimice. Preparatul este preparat prin omogenizând hepatopancreas crab specii țintă în soluții tampon, eliminarea solidelor prin centrifugarea omogenatului floculare cu lipide chitosan. Omogenatul este apoi purificat prin centrifugare. Ultrafiltrarea soluție preparatul enzimatic se realizează pe o substanță permeabilă membrană cu o greutate moleculară de 15 kDa sau mai puțin, iar apoi membrana, agent de retardare având o greutate moleculară de 50 kDa sau mai mare. Soluția care conține activitățile enzimatice este liofilizată. Compoziția include un proteinaza colagenolitice preparare polyfermental metallozavisimye și având o greutate moleculară mai mică de 30 kDa, ribonucleaza, deoxiribonucleoză, fosfodiesterazelor, fosfatazele, amilaze, lipaze și Glucanaza. Invenția furnizează un multienzimatic arsenal extensie de medicamente pentru creșterea randamentului preparatului enzimatic prin creșterea cantității de tipuri de enzime în multienzimei complexe (proteaze, nucleaze, lipazele și glicozidazele), ridicarea nivelului de activitate al hidrolaze, extinderea gamei de posibile utilizarea medicamentului polyfermental în diverse industrii. 2 z.p. f-ly.
Invenția se referă la un medicamente multienzimatic din materiale de origine animală marine și metode pentru prepararea acestora și pot găsi aplicații în biotehnologie, medicină, cosmetică, medicină veterinară, agricultura, cercetarea și producția de reactivi biochimice.
La crustacee (crabi, raci și creveți), hepatopancreasul este un organ care combină funcțiile ficatului și pancreasului. Datorită caracteristicilor unității de putere hepatopancreasului Decapoda secreta cantitati mari de enzime digestive care hidrolizează toate clasele de polimeri naturali și care au o specificitate largă și activitate neobișnuit de mare. Hepatopancreas este o materie primă accesibilă, ieftină și netoxică pentru obținerea preparatelor enzimatice. În momentul hepatopancreas crab izolat în proteinaza înalt purificată sau omogen stare colagenolitice, aminopeptidază, tripsină, elastază, și Ca, Mg DNAza-dependent.
În același timp, preparatele de polimerizare obținute din hepatopancreas de crabi conțin, de regulă, hidrolaze de un singur tip, și anume proteazele colagenolitice. Pe baza proteinazelor colagenolitice, s-au dezvoltat preparatele de vindecare a rănilor "Collalitin", "Morikrase", "Collase", "Collagenase KK".
Sunt cunoscute următoarele metode de obținere a preparatelor enzimatice din hepatopancreas de specii de crab comercial:
1. Procedeu de preparare a unui complex de enzime proteolitice, cuprinzând omogenizarea materiei prime într-o soluție apoasă și precipitarea produsului dorit cu sulfat de amoniu. Complexul enzimatic conține tripsină, carboxipeptidază A și B, aminopeptidază leucină, proteaze alcaline și neutre [SU 546648 A1, 15.02.77].
2. Procedeu pentru prepararea unui complex de enzime proteolitice ale organelor digestive terestre și animale marine, care cuprinde o extracție complexă a soluției de clorură de tocat corpurile de calciu, eliminarea solidelor prin membrane de centrifugare și microfiltrare. Produsul (complex proteolitică) conține alcalină, protează neutră și acidă, tripsina, chimotripsina, colagenaza [RU 2034028 C1, 30.04.95].
3. Procedeu de obținere a unui preparat enzimatic care conține o enzimă extrasă din congelate roșu Hepatopancreasul regele crab de soluție alcalină de clorură de metal; separarea sedimentelor prin trecerea prin filtre cu o dimensiune a porilor de 10 mm, 0,5 mm și 0,1 mm; microfiltrarea pe membrane cu o dimensiune a porilor de 0,45 μm; ultrafiltrarea pe membrane cu o limită de transmisie de 10 kDa. Preparatul enzimatic denumit "Kollalitinom" cuprinde proteazele colagenolitice [RU 2096456 C1, 20.11.97].
Dezavantajul acestei metode este durata procesului, ceea ce reduce randamentul produsului și nivelul activității sale. Colagenaza este reprezentată de trei izoenzime cu o greutate moleculară cuprinsă între 18 și 27 kDa.
4. Cel mai aproape metodei revendicate de esența tehnică este o metodă de obținere a unui preparat enzimatic de la hepatopancreas crab specii comerciale cu activitate colagenolitică (colagenaza). Metoda prevede omogenizarea materiei prime prin autoliză în soluții tampon, urmat de adăugarea la omogenatul a soluției de chitosan la concentrația finală de 0,01-0,4%, care separă materialul insolubil și soluție de enzimă ultrafiltrare secvențială mai întâi pe o membrană cu o roughage cutoff o greutate moleculară de 100 kDa sau mai mult, și apoi pe o membrană cu un prag de greutate moleculară substanțe 30 kD sau mai puțin, colectarea enzima nu trece prin membrană. Soluția conținând activitatea enzimatică au fost liofilizați [RU 2039819 C1, 20.07.95).
Metoda prototip este destul de simplă în execuție, nu consumatoare de timp, nu necesită reactivi toxici. Cu toate acestea, în preparatul obținut prin metoda prototipului, s-a determinat un singur tip de hidrolază, și anume proteazele colagenolitice.
Pe baza acestui complex în Institutul Pacific de Chimie Bioorganic vindecarea ranilor create larg spectru „Colagenaza KK„, în care colagenazei este reprezentat de cel puțin trei izoenzime [RU 2093166 C1, 20.10.97].
În prezent, domeniul de aplicare al complexului enzimatic cunoscut este limitat numai de capacitatea sa de a degrada proteinele. În același timp, în multe cazuri, soluționarea cu succes a unei probleme specifice necesită utilizarea de medicamente polenzimatice cu un spectru mai larg de acțiune. De exemplu, pentru distrugerea enzimatică completă a animalelor și a celulelor de plante care utilizează produse de hidroliză în industriile biotehnologice, microbiologice și alimentare.
Obiectul invenției - pentru a crea preparare multienzimatic capabile să hidrolizare 4 clase de biopolimeri naturali, cum ar fi proteine, acizi nucleici, polizaharide și lipide cu scopul aplicării sale mai largi și mai eficiente; extinde arsenalul preparatelor enzimatice complexe derivate din Hepatopancreasul de specii comerciale de crabi și de a dezvolta o metodă de preparare a acesteia.
Ca rezultat, noi soluții multienzimatic medicamente ale problemei create conținând proteinaza colagenolitice, care, conform invenției, mai cuprinde proteaze metallozavisimye, ribonucleaza, deoxiribonucleoză, fosfodiesterazelor, fosfatazele, amilaze, lipaze și # X003B2; -glucanase. Acesta a fost preparat prin omogenizarea Hepatopancreasul de specii comerciale de crabi în soluții tampon, îndepărtarea impurităților solide omogenat prin centrifugare, floculare chitosan lipidic preparat enzimatic ultrafiltrare a soluției pe o substanță permeabilă membrană cu o greutate moleculară de 15 kDa sau mai puțin, iar apoi membrana, agent de retardare având o greutate moleculară de 50 kD și mai sus.
Rezultatul tehnic este asigurat de faptul că noul preparatul complex enzimatic conține 4 tip hidrolază - proteaze, nucleaze, lipaze și glicozidazele, adică are un spectru mai larg de activități enzimatice în comparație cu cunoscut preparatul având doar un singur tip de activitate de hidrolază, și anume - colagenolitică.
În legătură cu cele de mai sus, prepararea poliezimei propusă poate fi utilizată în practică mai eficient decât cele cunoscute. De exemplu, atunci când se utilizează medicamentul în medicină, în tratamentul proceselor necrotice cauzate de infecții bacteriene sau virale, această eficiență va oferi o combinație unică de acțiune litică colagenoze, proteaze și nucleaze și efectul antiviral al DNază și RNazei.
Mai mult, complexul propus poate servi drept sursă pentru metode biochimice convenționale enzime individuale sau enzime complexe de acțiune direcționate, cum ar fi complexul DNaza și RNaza. Prezența comună a preparatului enzimatic propus de DNaza și RNaza va crea pentru medicină, medicină veterinară, agricultură, medicamente anti-virale, care va oferi capacitatea de a inhiba simultan multiplicarea virusurilor ADN și ARN la oameni, animale și plante.
Noul medicament extinde arsenalul preparatelor enzimatice complexe.
Sarcina este rezolvată, de asemenea, o metodă de obținere a preparatului enzimatic care cuprinde proteinaza colagenolitice, care cuprinde hepatopancreas omogenizatoare specii de crab de pescuit, adăugarea la omogenatul a soluției de chitosan, separarea materialului insolubil, urmată de ultrafiltrare soluției rezultate și produsul dorit prin liofilizare în care, conform invenției, omogenizatul este supus purificare ulterioară prin centrifugare, iar ultrafiltrarea este realizată pe o substanță permeabilă membrană cu molecular masa clorhidric de 15 kDa și de mai jos, colectând preparatul enzimatic nu trece prin membrană. Apoi, ca rezultat formularea de concentrat de enzimă care conține 4 tipuri de hidrolaze au trecut prin membrană, agent de retardare având o greutate moleculară de 50 kDa sau mai mare. Ca rezultat, un preparat care cuprinde suplimentar metallozavisimye proteinaza colagenolitice și având o greutate moleculară mai mică de 30 kDa, ribonucleaza, deoxiribonucleoză, fosfodiesterazelor, fosfatazele, amilaze, lipaze și Glucanaza.
Procesul poate fi realizat atât la o temperatură scăzută, de exemplu 5 ... x000B0, C (în condiții de frig) și la temperatura camerei.
Chitosanul se adaugă la omogenizatul la o soluție a formei de sare cu un acizi organici sau minerali. Introducerea de etape suplimentare de purificare prin centrifugarea omogenizatului pentru a reduce concentrația de până la 0,001% din chitosan, care, la rândul său, reduce pierderea de proteine asociate cu sorbția proteinei la chitosan, ca rezultat - crește randamentul complexului enzimatic.
Utilizarea membranelor cu o transmisivitate sub 50 kD face posibilă îndepărtarea biopolimerilor de balast cu o greutate moleculară mai mare de 50 kD și astfel crește activitatea specifică a enzimelor prezente în complex.
Totalitatea caracteristicilor esențiale ale metodei revendicate furnizează un rezultat tehnic, care constă în creșterea randamentului preparatului enzimatic prin creșterea cantității de tipuri de enzime în multienzimei complexe (proteaze, nucleaze, lipazele și glicozidazele), precum și în creșterea activității hidrolazelor.
Exemple de realizări ale invenției
Se obțin 80 g de preparat enzimatic complex. Medicamentul conține 0,8 mg de proteine pe mg de medicament. Lipidele din preparat sunt absente.
EXEMPLUL 2 hepatopancreas crab din speciile țintă (10 kg) a fost zdrobit, și plasat în 30 L de apă, ajustând pH-ul soluției de bicarbonat la o valoare de 8,3 și se menține sub agitare timp de 6 ore la o temperatură de 5 ° C # x000B0;. Soluția a fost apoi centrifugat la 3000 g și s-a adăugat la supernatant sub soluție de chitosan agitare puternică în 0,5 n. acid clorhidric, aducând concentrația finală de 0,001% din chitosan, la flocularea pH - 7,0. Procedeul se realizează așa cum este descris în exemplul 1, la o soluție tampon pH 8,3.
Se obțin 78,0 g de preparat enzimatic complex. Preparatul conține 0,85 mg de proteină pe mg de medicament. Lipidele din preparat sunt absente.
Se obțin 7,2 g de preparat enzimatic complex. Medicamentul conține 0,75 mg de proteine pe mg de medicament. Lipidele din preparat sunt absente.
Se obțin 7,4 g de preparat enzimatic complex. Medicamentul conține 0,78 mg de proteine pe mg de medicament. Lipidele din preparat sunt absente.
Preparatul enzimatic obținut prin metoda revendicată are următoarele caracteristici:
pulbere galben-gri, solubilă în apă distilată sau soluție tampon, cu un miros ușor specific; preparatul nu conține ioni de metale grele, impurități, substanțe nocive și toxice; preparatul practic nu își pierde activitatea în decursul a 4 ani de depozitare într-o stare liofilizată la o temperatură de + 10 ° C;
Activitatea colagenolitică specifică (colagenul de tip I) nu este mai mică de 1,5 U / mg medicament / min (determinarea activității colagenolitice specifice este efectuată conform MA 123.12.002-92);
activitatea specifică a proteinazei tip tripsină (N-benzoil-arginină-p-nitroanilidă) este de cel puțin 3,3 U / mg medicament / min (determinarea activității proteinază este efectuată conform metodei lui Erlanger);
activitatea specifică proteolitică totală (cazeina) nu este mai mică de 0,7 U / mg medicament / min (determinarea activității proteolitice se efectuează conform metodei standard în conformitate cu GOST 20264.2-88);
activitatea specifică a RNAzei alcaline nu este mai mică de 35 U / mg medicament / oră;
activitatea specifică a RNazei acide nu este mai mică de 10 U / mg medicament / oră;
Activitatea specifică de DNază nu este mai mică de 400 U / mg medicament / oră;
activitatea specifică a fosfatazei alcaline nu este mai mică de 0,04 U / mg medicament / min;
activitatea specifică a fosfodiesterazelor alcaline și acide nu este mai mică de 0,003 U / mg medicament / min;
activitate specifică Glucanaza nu este mai mică de 0,01 U / mg medicament / min;
activitatea specifică a amilazei nu este mai mică de 0,01 U / mg medicament / min;
activitatea specifică a lipazei nu este mai mică de 250 U / mg medicament / min.
Determinarea activității enzimatice se efectuează conform metodelor prezentate în cataloagele Sigma.
În timpul cercetării sa constatat că greutatea moleculară a enzimelor complexului cu cea mai mare activitate este de 15-42 kDa. Componentele cele mai active ale complexului sunt proteinazele collagenolitice serice, metaloproteinazele, DNaza alcalină, RNAza alcalină și acidă, amilaza.
1. Procedeu pentru prepararea unui preparat enzimatic de la hepatopancreas crab specii comerciale care conțin proteinaza colagenolitice, care cuprinde omogenizarea hepatopancreas crab comerciale într-o soluție tampon, adăugarea unei soluții de chitosan într-un acid, separarea materialului insolubil, urmată de ultrafiltrare a soluției rezultate la liofilizarea și produsul așteptat, caracterizat prin aceea că omogenatul este supus purificare suplimentară prin centrifugare și ultrafiltrare se realizează pe o membrană permeabilă eschestva cu o masă moleculară de 15 kDa și de mai jos, colectând preparatul enzimatic nu trece prin membrană, și apoi extractul concentrat și desalinizat este trecut prin membrana, agent de retardare având o greutate moleculară de 50 kDa și mai mare, pentru a obține un preparat, care cuprinde suplimentar proteaze metallozavisimye, ribonucleaza, deoxiribonuclează, fosfodiesteraza, fosfataza, amilaza, lipaza și Glucanaza.
2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că omogenizarea și purificarea se efectuează la un pH al soluției enzimatice de 5,5-9,5 și la o temperatură de 5 ... 20 ° C.
3. Preparat din hepatopancreas crab specii comerciale de enzime care conțin proteinaza colagenolitice, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde suplimentar proteaze metallozavisimye, ribonucleaza, deoxiribonucleoză, fosfatazele, fosfodiesterazelor, amilaza, lipaza și Glucanaza și obținută prin metoda din revendicarea 1 sau 2.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: