O metodă pentru producerea unui inhibitor de colagenază din hepatopancreas de specii de crab comercial, o bancă de brevete

Invenția se referă la biotehnologie, în special la producerea inhibitorilor de colagenază și poate fi folosită în medicina veterinară, în industria alimentară și în scopuri de cercetare. Metoda prevede omogenizarea hepatopancreasului speciilor de crab comercial în acetat de amoniu 0,1 M conținând acetat de calciu 0,1-1 mM la pH 6,4-7,0. Omogenatul este centrifugat. Sulfatul de amoniu se adaugă la supernatantul rezultat până la o saturație de 60-70% și se centrifughează. Complexul enzimatic rezultat este dizolvat în apă distilată cu adăugarea de 0,1-1 mM acetat de calciu pentru a obține soluția adevărată, urmată de purificarea și concentrarea acesteia. Desalinizarea enzimelor pe o membrană din polifie cu o dimensiune a porilor de 100 kDa. Supernatantul care conține inhibitorul de colagenază este spălat cu apă distilată. Se încălzește până la 60-100 ° C și precipitatul se separă prin centrifugare. Soluția enzimatică este liofilizată. 2 z.p. f-ly, 1 il. 1 tab.







Invenția se referă la biotehnologie, în special pentru prepararea de preparate cu puritate înaltă și foarte active ale inhibitorilor enzimei care pot fi utilizați în medicină, cosmetică, medicină și industria alimentară de uz veterinar, precum și în scopuri de cercetare.

Colagenele crabului rege sunt utilizate cu succes în medicină pentru tratamentul arsurilor, ulcerului purulent-trofic, cicatricile postoperatorii. Mecanismul procesului de vindecare la utilizarea medicamentului proteolitică / acțiune colagenolitice constă în lizeze țesutului necrozat, ceea ce duce la purificarea rănilor. Următoarea etapă este procesul de vindecare a rănilor, restaurarea de noi celule ale țesuturilor și pielii. Dacă concentrația de colagenaze și enzime colagenolitice în preparatul este foarte mare, procesul de recuperare poate fi încetinită prin hidroliza colagenului prin aceste enzime tesut sanatos, deci este necesar pentru a bloca acțiunea enzimatică. Acest lucru este deosebit de important în tratamentul bolilor oculare. Majoritatea fiziologic metoda - utilizarea de inhibitori adecvați, cu toate acestea, ca și colagenaze și enzime colagenolitice rezistente la cunoscuți inhibitori ai tripsinei și chimotripsina. Collagenurile determină degradarea colagenului, care este asociată cu îmbătrânirea prematură a pielii. Prin urmare, inhibitorul de colagenaze poate fi introdus în diverse produse cosmetice (creme, loțiuni, geluri, unguente) pentru a preveni ridurile sau pentru a trata atrofia pielii.

O metodă de producere inhibitor de proteinază (dar nu și colagenaze) din corpurile de bovine, care constă în aceea că materia primă este măcinat, extracția se efectuează într-un mediu acid, este tratat cu extractul după îndepărtarea precipitatului titlu se izolează produsul prin cromatografie pe tip adsorbant silicat și precipitat din eluatul organic solvenți. Conform metodei menționate, produsul poate fi izolat la activitatea 500-1500 KIU / mg, cu toate acestea, produsul nu îndeplinește cerințele specificate pentru inhibitor medicamente proteinază.

Brevetul german nr. 1499211, A 61 până la 17/00, 1972.

Este cunoscută o metodă pentru producerea unui inhibitor de colagenază din cartilagiul de rechin. extracte de cartilagiu de rechin au activități anti-angiogen, protivoopuholevoproliferiruyuschey directă, anti-inflamatorii și antikollagenoliticheskoy. Metoda cuprinde etapele de obținere a unui omogenat de cartilagiu într-o soluție apoasă, centrifugarea omogenizatului și această fractionating în continuare aceasta pentru a obține un extract complet care conține molecule de până la 500 kDa. fracționare suplimentară a extractului prin ultrafiltrare pe membrane filtrante și filtrare pe gel pe S-12, Superose și cromatografia hidrofobă pe SDS-S-hexil în modul FPLC (cromatografie lichidă de înaltă presiune), lăsat să aloce una dintre fracțiile de extract (10 kDa) având activitate anticollagenolitică. Efectul inhibitor asupra colagenază tip 1 (MMT1) a fost determinată de substrat fluorogenic și prin electroforeză pe SDS-PAGE.

Metoda este foarte complicată în execuție, deoarece în faza de fracționare include o mulțime de operații complexe laborioase care pot fi efectuate numai în laboratoare bine echipate. În plus, sursa inhibitorului - cartilagiu de rechin este substanțial lipsită de enzime proteolitice, iar inhibitorul obținut prin procedeul de mai sus se referă la inhibitori ai metaloproteinazelor.

Cea mai apropiată soluție tehnică este o metodă de obținere a inhibitorului de bază proteinază (dar nu și colagenaze) din corpurile de bovine, constând în aceea că organele de bovine care conțin inhibitor (plămân, pancreas, glande salivare, măcinat (omogenizat), extracția se efectuează în condiții acide, cake separate, lipide și proteine ​​sunt eliminate, centrifugate, inhibitor bazic extract-proteinaza a fost cromatografiat pe sulphocationite, eluatul a fost tratat cu acid clorhidric până la pH 1-3, precipitatul a fost îndepărtat proteinele balast , Supranatantul rezultat a fost tratat cu acid tricloracetic sale concentrație 2.5-7.0%, se îndepărtează din nou proteine ​​contaminante din supernatantul sărat inhibitor de proteinază primar, care este apoi purificat prin cromatografie pe Sephadex, iar apoi medicamentul este izolat prin precipitare cu acetonă sau prin uscare prin congelare. Un apirogene un medicament a cărui activitate nu este mai mică de 5000 KIE / mg.







Dezavantajele procedeului este un proces în mai multe etape, utilizarea unor cantități mari de solvenți inflamabili scumpi organici (alcool, acetona) și concentrații mari tricloracetici de acid (50%) de acid clorhidric și hidroxid de sodiu, care necesită utilizarea unor condiții speciale, de asemenea, să afecteze în mod negativ condițiile de mediu, care necesită elaborarea de metode speciale pentru reciclarea deșeurilor de producție. Un dezavantaj semnificativ este utilizarea unei coloane cu Sephadex costisitoare de producție importată în etapa de desalinizare a preparatului. În esență, această metodă de laborator în mai multe etape pentru producerea unui inhibitor nu se pretează la scalare.

Obiectivul invenției este acela de a furniza o metodă de izolare a inhibitorului endogen endogene anterior necunoscut al enzimelor colagenolitice din hepatopancreasul crabului rege în mod economic.

Problema este rezolvată prin aceea că în procedeul de obținere a unui inhibitor de colagenaza care cuprinde omogenizând materie primă care conține enzime proteolitice, metoda se caracterizează prin efectuarea omogenizarea materiei prime în acetat de amoniu 0,1 M conținând 0,1-1 mM acetat de calciu la pH 6.4-7, 0, apoi omogenizatul a fost centrifugat, la supernatant a fost adăugat sulfat de amoniu până la 60-70% saturație, complexul enzimatic rezultat este separat prin centrifugare, acesta a fost dizolvat în apă distilată, cu adaos de 0,1-1 mM acetat de calciu pentru a obține adevărata întindere ora, urmat de enzime de purificare, concentrare și polyfiber desalinizarea pe membrana cu o dimensiune a porilor de 100 kDa și se spală supernatantul conținând colagenază inhibitor de apă distilată, urmată de încălzire la 60-100 ° C, care separă precipitatul prin centrifugare și uscare prin înghețare.

În mod tipic, supernatantul este spălat cu apă distilată de cel puțin 3 ori și încălzirea supernatantului este condusă de preferință la 80-85 ° C timp de 25-40 de minute.

Hepatopancreas de crabi, în special regele crab, este o sursă de enzime proteolitice, incluzând colagenaza, sunt capabili să formeze complecși cu inhibitor endogen, enzime colagenolitice hepatopancreas de crab sunt o familie de enzime speciale - brahiurinam. Această serin proteaze care combină proprietățile de tripsina și chimotripsina, prin urmare, inhibitori ai metaloproteinazelor acționează asupra lor. Hepatopancreas este disponibil, ieftin și de materii prime non-toxice pentru producția de preparate enzimatice, cu toate acestea selectarea inhibitor al enzimei necunoscute anterior colagenolitice endogen din Hepatopancreasul regelui crab este principalul obiectiv al prezentei invenții.

Inhibitorul obținut conform metodei invenției este o pulbere brun deschis, ușor solubilă în soluții apoase tampon.

In studiul efectului inhibitor al preparatului obținut folosind substratul cromogen colagenolitice serin proteinaza PC Glp-Ala-Ala-Leu pNA sa demonstrat că activitatea inhibitoare este dependentă de doză. Rezultatele studiilor sunt prezentate în tabel.

Inhibarea activității de colagenază a Morikraza a fost confirmată prin electroforeza hidrolizei de tip I a colagenului.

Desenul prezintă caracteristica electroforetică a inhibitorului și efectul activității colagenolitice inhibitoare a preparatului „Morikraza“. 12% PAGE, incubarea a fost efectuată la temperatura camerei. Lane 1 - preparat "Morikraza", banda 2 - preparare inhibitor, culoarul 3 - pregătirea inițială a colagenului de tip I, banda 4 - preparare de colagen + medicament "Morikraza" într-un raport de 30: 1, timp de 1 oră de incubare inhibitor + medicament fără incubare cu l; benzi 5-8: incubarea cu inhibitor de 2 ore, raportul dintre enzimă: inhibitor = 1: 100 - piesa 5 (timpul de incubare cu colagen „Morikrazoy“ 1 oră) și culoarul 6 (timpul de incubare cu colagen „Morikrazoy“ 24 ore); enzimă raportul: inhibitor = 01:50 - culoarul 7 (timpul de incubare cu colagen „Morikrazoy“ 1 oră) și banda 8 (incubare cu colagen „Morikrazoy“ timp de 24 de ore). Săgeata marchează poziția benzii corespunzătoare colagenului neperturbat.

Acțiunea de colagenază a medicamentului este blocată în prezența unui inhibitor endogen în raportul enzimă: inhibitor de nu mai puțin de 1: 100.

După cum se vede din desen, numai când raportul medicament „Morikraza“: inhibitor = 100: 1 există o inhibare completă a activității colagenazei adevărate (vezi culoarele 5 și 6.). Puritatea inhibitorului este demonstrată de banda 2, unde sunt vizibile numai două benzi de proteine ​​intense. Poate că aceasta este o izoformă a aceluiași inhibitor.

Metoda propusă prevede un inhibitor endogen necunoscut anterior al enzimelor colagenolitice din hepatopancreas regelui crab mod destul de economic prin utilizarea tehnicii de micro-filtrare pe o membrane special selectate. Acest lucru permite reducerea semnificativă a timpului procesului și reducerea costului de producție al inhibitorului. Efectuarea membranei microfiltrare cu o dimensiune a porilor de 100 kDa permite eliminarea impurităților cu greutate moleculară mică și enzime colagenolitice complet conservarea inhibitor efectua desalinizarea și concentrația medicamentului în același aparat, rezultând în soluții concentrate, timpul de uscare, care este redus în mod semnificativ. Salting-ul de proteine ​​cu sulfat de amoniu ieftine la acid slab și pH neutru promovează retenție de inhibitori și proces mai ieftin. Mai mult, utilizarea de sulfat de amoniu și acetat de inhibitor de extracție și sărare în loc de alcool, acetonă, acid tricloracetic, aplicat pe un prototip, care este mai mult în ceea ce privește siguranța mediului a procesului, deoarece soluțiile de săruri de amoniu în timpul diluării pot fi utilizate pentru fertilizarea plantelor.

Revendicarea invenției

1. Procedeu de obținere a unui inhibitor de colagenaza de la hepatopancreas crab speciile țintă, caracterizat prin efectuarea omogenizarea materiei prime în acetat de amoniu 0,1 M conținând 0,1-1 mM acetat de calciu la pH 6,4-7,0, omogenizatul a fost centrifugat, supernatantul s-a adăugat la sulfat amoniu 60-70% enzime putere de saturație rezultate complex se separă prin centrifugare, acesta a fost dizolvat în apă distilată, cu adaos de 0,1-1 mM acetat de calciu pentru a se obține o soluție limpede, urmată de purificare, concentrare și enzimă desalinizarea polyfiber pe membrană cu o dimensiune a porilor de 100 kDa și spălare supernatant inhibitor conținând colagenază, apă distilată urmată de încălzire la 60-100 ° C, care separă precipitatul prin centrifugare și uscare prin înghețare.

2. Metodă conform revendicării 1, în care supernatantul este spălat cu apă distilată de cel puțin 3 ori.

3. Metodă conform revendicării 1, în care încălzirea supernatantului este condusă de preferință la 80-85 ° C timp de 25-40 de minute.







Articole similare

Trimiteți-le prietenilor: