Orice laborator pentru replicarea miceliului trebuie să se bazeze pe laboratorul culturilor uterine. Considerăm că este inacceptabil să combinăm în același spațiu replicarea miceliului și pregătirea inoculului uterin.
În laboratorul de culturi uterine sunt rezolvate următoarele sarcini:
• depozitarea și întreținerea unei colecții de culturi pure;
• producția de inocul pentru replicarea sa;
• controlul culturilor stem în termeni de puritate și parametri morfologici și culturali.
Colecția de culturi pure este cel mai important lucru pe care îl are un astfel de laborator. Conservarea culturilor mamei stem este principala sarcină a LMC, deoarece toate culturile stocate în laboratoare domestice sunt obținute prin schimb, cumpărare sau alocare de miceli din corpurile de fructe. Acest lucru înseamnă că nici un laborator din Ucraina și Rusia nu are (până în prezent) o adevărată cultură uterină a hibrizilor. Hibrizi adevărați se obțin prin trecerea a două soiuri, fie printr-o varietate, fie printr-o tulpină sălbatică. Metoda de obținere a unui soi este proprietatea și "know how" -ul firmei și numai firma care a primit-o și are formularele părinților originale pentru ao actualiza poate actualiza hibridul.
Hibrizii sunt de obicei foarte instabili, astfel încât hibrizii dobândiți necesită o abordare profesională a întreținerii și stocării lor. În ceea ce privește stocarea și întreținerea calificată a culturilor stem uterine, caracteristicile caracteristice datorate caracteristicilor genetice ale soiului ar trebui să rămână neschimbate.
MEDIU PENTRU DEPOZITAREA CULTURILOR CURATE
Scopul principal, urmărit în optimizarea compoziției materialelor utilizate pentru stocare, este de a încetini procesul metabolic cât mai mult posibil și, în consecință, de a crește cultura. În același timp, conținutul de umiditate al mediului trebuie să fie de așa natură încât în timpul anului nu este posibilă realizarea traverselor datorită uscării lor.
Culturile pure sunt stocate în tuburi de testare pe medii nutritive agarizate (Figura 1). Agar-agar este o polizaharidă derivată din anumite soiuri de alge. Nu este un nutrient și servește numai la compactarea mediului. În apă, agar-agar se topește la o temperatură de 80-100 ° C, îngheață la 40-45 ° C.
Fig. 1. Un tub cu un mediu nutritiv agarizat
Iată câteva rețete pentru mediile nutritive:
• agar de cartofi-glucoză (g / l):
curățate și tuberculate de cartofi tocate - 200 g
agar-agar - 15-20 g (sau agaroid 35-40 g)
bere nelegată - 250 ml (0,25 l)
agar-agar-15-20 g
Berea de bere poate fi înlocuită cu un decoct de cereale.
Pentru a pregăti un mediu de cartof-glucoză, tuberculii de cartofi sunt fierți până la fierbere, bulionul este filtrat, volumul filtratului este adus la 1 litru. Adăugați glucoză, agar-agar. Mediul este încălzit până când agarul-agar este complet topit.
Pentru a prepara mediul de must-agar, pH-ul mustului ar trebui să se situeze în intervalul 4-4,5.
Ciupercile ciupercilor, ciupercile, ciupercile de ciuperci de Mycelia sunt bine conservate într-un mediu în care în loc de must a folosit un bulion de cereale care conține toate componentele necesare creșterii culturii.
Mediile preparate sunt turnate în tuburi (20x200 mm) de câte 10 ml fiecare. Tuburile sunt acoperite cu dopuri din bumbac. Fișa trebuie să intre în gâtul tubului de încercare cu două treimi lungime, nu prea strânsă, dar nu liberă. La împrăștiere este necesar să se asigure că mediul nu umezește muchiile tubului de testare, în caz contrar acestea pot adera la prize. Se toarnă 15 ml de mediu în feluri de mâncare Petri, distribuindu-l uniform pe fundul paharului.
Mediul pregătit este pregătit pentru sterilizare. Steriliza tuburile cu mediul, la o presiune de 1,5 atm. într-o autoclavă timp de 1 oră. După aceea, tubul de mediu agar topit îndepărtat din autoclavă și plasată într-o poziție înclinată, astfel încât mediul nu depășește 2/3 din tub, sau poate umezi dopul, ceea ce este inacceptabil.
Când mediul este solidificat, tuburile sunt așezate vertical și se scurge apa de condens (pentru aceasta, vasele Petri sunt așezate cu capul în jos).
Mediile sterilizate sunt plasate într-un termostat la 28 ° C timp de câteva zile. În cazul în care creșterea bacteriilor sau a coloniilor de fungi nu este observată la suprafață și în mediu, mediul este considerat steril și transferat în culturi.
METODE DE STOCARE A CULTURILOR CURATE
Există două metode principale de stocare a culturilor stem uterine:
• metoda pasajelor vegetative;
• Depozitarea în azot lichid la o temperatură de -196 ° C
Cel mai potrivit și accesibil pentru LMC este prima metodă.
Mai jos sunt enumerate principiile de bază ale depozitării, care permit evitarea mutațiilor hibride în timpul depozitării culturilor:
• optimizarea suporturilor utilizate pentru stocare;
• utilizarea de medii nutritive epuizate;
• Reducerea frecvenței pasajelor;
• Respectarea conditiilor de depozitare, care incetinesc procesele de crestere si metabolism (la o temperatura de +5 ° C);
• utilizarea mediilor nutritive de aceeași compoziție la fiecare pas succesiv de cultură;
Unul dintre parametrii importanți ai memoriei este durata acesteia. Se știe că, cu cât mai puțin este colectată colecția, cu atât mai puține posibilități sunt create pentru mutațiile culturii originale. Pentru a evita transplanturile frecvente, numărul de unități din fiecare depozitare a unei tulpini ar trebui să fie suficient timp de cel puțin un an.
Depozitarea culturilor pure prin metoda pasajelor vegetative
Pentru a menține culturile și pentru a păstra colecția în laborator, aceștia transportă miceliul în medii nutritive proaspete. Datorită re-culturii periodice, cultura este în permanență în funcțiune și puritatea sa este monitorizată.
Tubul de cultură este luat în mâna stângă pe palmă, paralel cu poziția degetelor și ținut cu degetul mare, astfel încât suprafața înclinată a mediului este vizibilă. În mâna dreaptă (ca stilou pentru scriere) luați acul de inoculare (cârlig micologic) și de câteva ori este transportat peste flacăra arzătorului pentru sterilizare (figura 2, a). Apoi, folosind degetul mic și degetul inelar al mâinii drepte, scoateți dopul din tubul de testare și ușor, de-a lungul peretelui, pentru răcire, introduceți cârligul. O mică bucată de miceliu este luată cu cârlig (figura 2b). Tubul cu cultură este închis.
Luați un tub de testare cu un mediu nutritiv proaspăt. Marginile tubului și dopurile sunt trecute prin flacăra arzătorului (figura 2, c). O bucată de miceliu este transferată pe mediu, închisă cu un dop. Pe o eprubetă cu inoculare, trebuie înregistrată data inoculării, numărul de tulpină și numărul de transplanturi.
Fig. 2. Schema de traversare a miceliului
Culturile transplantate sunt plasate într-un termostat la 24-26 ° C și lăsate acolo până când substratul este complet murdar. În primele zile, se recomandă monitorizarea creșterii, deoarece în acest moment este mai ușor să se detecteze contaminarea.
Metoda de recoltare periodică (metoda pasajelor vegetative) este cea mai obișnuită metodă de stocare a culturilor de colectare. Cu cât colecția este mai puțin frecventă, cu atât mai puține diviziuni celulare sunt supuse culturii și cu cât este mai aproape de izolatul inițial în proprietățile sale. Pentru a evita reintroducerea frecventă, numărul unităților de stocare ar trebui să fie de așa natură încât nu trebuie să se facă pasaje suplimentare în timpul perioadei în care este stocată cultura. Nu se recomandă re-cultura mai mult de o dată pe an. Culturile transplantate pot fi depozitate la temperatura camerei, însă temperatura optimă pentru depozitarea culturilor între transecte este de 4-5 ° C.
Depozitarea culturilor pure în azot lichid la o temperatură de -196 ° C
Informația privind depozitarea culturii în azot lichid la o temperatură de -196 ° C este prezentată în "Ghidul colectorului de ciuperci micologi", Kiev, "Naukova Dumka", 1987, p. 420-421.
Înainte de miceliu de depozitare este incubat la o temperatură de + 5 ° C timp de 1-7 zile. Apoi, într-o cu una sau două fiole din sticlă milimetrice plasate 6-8 boabe miceliu supradezvoltat, și 0,5 ml de dimetil sulfoxid glicerol - mediu protector de suspensie. Înainte de flacoane congelare miceliu a fost păstrat la temperatura camerei, timp de o oră. Congelarea se efectuează lent, tehnologie care asigură controlul procesului de răcire. Cultura congelată depozitată în frigider cu azot lichid la o tempera-160-rotund. -196 ° C. Pentru a restaura fiolele miceliene congelate într-o baie de apă menținută la 38 ° C până când ultimele urme dispar gheață. Înainte de duplicarea miceliul este necesară pentru a verifica viabilitatea și puterea de creștere. Se crede că această metodă vă permite să păstrați tulpinile pentru o lungă perioadă de timp, fără modificări semnificative în genotipul.
SELECȚIA CULTURILOR CURATE
Pentru a completa colecția de culturi de tulpini, este necesar să se poată izola culturile pure. Culturile pure pot fi izolate de un miceliu de semințe, de la organisme de fructe, cu germinarea bazidiospore. Considerăm că numai prima metodă (izolarea din miceliul de semințe) este potrivită pentru obținerea culturilor pure de tulpini hibride, deoarece numai această metodă permite obținerea celei mai exacte copii a tulpinii.
Obținerea de culturi pure din miceliul inoculat
Pentru a obține culturi pure de inocul miceliumului luate nedezvăluită ambalaje miceliului comercial cel mai bun Plot selectat frecate vizual incizie alcool coajă se face și câteva boabe transferate în eprubete cu mediu nutritiv teșite. Întreaga procedură se efectuează într-o cutie sterilă. Tuburile inoculate au fost incubate într-un termostat la o temperatură de 24-26 ° C În timpul incubării, monitorizarea microbiologică se efectuează zilnic. Trebuie amintit că, pentru a evidenția cultura miceliu comercial este necesar să se utilizeze numai produsele din liderii mondiali în producția de miceliu (de exemplu, «Sylvan» de companie). În acest caz, puteți obține o cultură hibrid a cincea generație.
Izolarea culturilor pure din corpurile de fructe
Dacă nu există nici o posibilitate de a oferi o cultură pură a miceliului dintre cei mai importanti producatori de vehicule comerciale, în cazuri excepționale, este posibil să se obțină o cultură pură a corpului rodirea. Izolarea culturii micelari pure trebuie efectuată din corpuri de fructe cu tulpini hibride. Pentru a face acest lucru, alegeți corpurile tinere de fructe intacte. Efectuați o selecție mai bună în ziua colectării.
corp de fructe este plasat pe o hârtie de filtru și de rupere deschisă de mijloc (la intersecția dintre picioare cu o pălărie) cu un bisturiu steril să taie bucăți de dimensiune tesatura 0.5-1 cm, fiecare bucată de steril intepatura de ac inoculare, este coborât în cupa cu o soluție de 3 la suta din câteva secunde peroxid de hidrogen și cu grijă peste flacăra arzătorului este transferată în eprubete pe un mediu nutritiv. Doar o singură bucată este plasată în fiecare tub, ceea ce este important pentru prevenirea infecțiilor. Tuburile de inoculum este plasat într-un termostat la o temperatură de perioada 24 - 26 ° C. Două zile mai târziu, bucăți de corp rodirea în tuburi opushayutsya miceliu în creștere. În procesul de creștere, se efectuează un control microbiologic.
Fig. 3. Schema de izolare a culturilor pure din corpurile de fructe
Izolarea culturilor pure din bazirosporii
Cultivarea bazidiospores poate fi produsă direct din corpurile de fructe prin metoda Frieze. capac ciupercă atașat cu vaselină la partea interioară a capacului goale vase sterile Petri cu agar mediu steril este turnat în 2-3 straturi cm capac cealaltă cupă, care, alternativ, timp de 5 minute cu un capac capac înlocuit. În acest timp, cupa reușește să ajungă de la câteva sute la câteva mii de basidiospore. Toate operațiunile sunt efectuate într-o cutie sterilă sau într-un dulap laminar. Plăcile Petri sunt plasate într-un termostat la o temperatură de 24-26 ° C. În timpul germinării bazidiosporei, este efectuat în mod constant controlul microbiologic.
Purificarea micelului din poluanți străini
Modul izolat sau o altă cultură poate fi afectată de colonii de fungi, drojdii, bacterii care, de obicei, observate cu ușurință. Dacă leziunea este mică, atunci puteți încerca să curățați cultura. În care porțiuni alese miceliene intacte buclă de inoculare sterilă și se transferă într-un mediu curat, cu un control microscopic obligatoriu.
Dacă este necesar, puteți face mai multe treceri pentru a vă asigura că cultura este cu adevărat curată. Înainte de replicarea unei astfel de culturi, trebuie verificată.
Plan de afaceri: Producția de ciuperci. Goremykin V.A. Bogomolov A.Yu.
Trimiteți-le prietenilor: