Celulele competente din punct de vedere chimic pot fi transformate cu un amestec de ligază brută (și, în general, ADN, localizat într-un tampon cu soluție salină moderată). Numărul de celule din ambalajele cu capacitate chimică este mult mai mic decât în cazul electrocompetitiv, astfel încât să puteți să semănați toate ambalajele pe o ceașcă.
Prepararea celulelor competente.
de la scurgere (-70 o C) pentru a dispersa bacteriile cu un accident vascular cerebral pe o ceașcă cu un mediu selectiv;
crească 37 o C, pe;
mai multe colonii (10-12) în diametru
Se introduc 2-3 mm într-un SOB de 40 ml într-un balon de 0,5-1,0 l.
se agită viguros (200-300 rpm)
* sau la 37 o C - competență de nivel mediu, dar timpul de creștere este scurt,
* sau la 18 o C (rearanjați scaunul balansoar într-o cameră rece) - competența este mai mare, dar timpul de creștere este de câteva zile;
toate manipulările ulterioare se desfășoară în frig.
în 50 ml cf-tub introduceți 30 ml de cultură;
0 ° C, 10-15 ';
CF 2-3krpm 4 o C, 10 ', fuzionează supernatantul;
CF 2-3krpm 4 o C, 20 ", îndepărtați cu atenție lichidul rezidual;
suspendați în 10 ml de tuberculoză;
0 ° C, 10-15 ';
repetați pașii 7 și 8;
resuspendați în 2 ml de TB;
+ DMSO până la 3,5% (70 pl);
0 ° C, 10-15 ';
clauza de repetare 14,15;
Clătiți 100 μl în tuburi frigorifice de 2 ml cu capace cu șurub;
înghețați în azot lichid;
Depozitați în azot lichid (mai bine) sau -70 o C.
pentru a prepara dintr-o soluție proaspătă de 100x (0,5 pg / ml) de pNNA 5ng / ml;
se agită 0,5M bMeEtOH în gheață și o parte alicotă de celule;
la o alicotă de celule competente se adaugă:
4 pl 0,5M bMeEtOH,
2 pl (10 pg) pADN;
0 ° C, 20-60 ';
42 ° C, 30 ", fără agitare;
imediat în gheață, 2 ';
+ 400 pl SOC;
strângeți bine capacul, agitați orizontal pe agitatorul bacterian 37 ° C, 30 ';
Se mănâncă 50μl pe vas cu antibiotic;
dacă colonia "N" a crescut, atunci competența = Nx106 [colonii / μg].
- similar cu "controlul";
- pe un alicot este posibil să se ia pDNA în volum o C (titrul nu se schimbă în același timp). A doua zi, se calculează numărul de celule pentru însămânțare și se seamănă.
10%.
Frecvența transformării este constantă până la
10 ng pDNA / 100 pl celule, apoi cade foarte repede.
Saturație în regiunea de 100-200ng / 100μl celule.
> 25ng / 100μl celule - transformante duble apar cu o frecvență vizibilă.
În cazul unui număr mare de transformări simple (de exemplu, clonarea plasmidelor), lucrarea poate fi accelerată semnificativ dacă (i) un volum mic de celule este luat pentru transformare
20 μl), (ii) se utilizează imediat după șocul termic (fără "revitalizare").
Am citit și am auzit opinii complet diferite cu privire la cerințele privind calitatea DMSO. Prin urmare, doar în cazul în care utilizați "Sigma, # D2650", ambalate sub argon (alicote în fiole de 5 sau 10 ml). Îl vom împacheta o dată și vom stoca ambalajul la -70 o C.
Principalele avantaje ale celulelor competente din punct de vedere chimic înainte de electrocompetență:
- Tratat Chimic Celulele competente pot fi transformate cu amestecul de ligare brut (ADN și, în general, situat la soluție salină tamponată moderat). În cazul electrocompetent - ADN trebuie curățat, deoarece (I) este concentrație prea mare de sare poate provoca o descărcare prin scânteie în celula (ii) atunci când apar shell elektrotransformatsii găurile de E. coli, ele pot penetra enzima utilizată pentru ligare.
- Numărul de celule din ambalajul electrocompetent este mult mai mare decât în cazul celor competente chimic, deci nu încercați să semănați prea mult de ambalare pe o ceașcă. Aceasta este plină de subpopulație (apariția coloniilor de satelit) și o scădere a competenței.
Creșterea la 37 ° C conduce la o dependență bruscă (cu o maximă acută) a competenței asupra densității celulare (A600 = 0,45 pentru DH10B). La 18 o C competența ridicată este realizată într-o gamă largă de A600 = 0,35-0,70.
Relația dintre concentrația celulelor și densitatea optică: OD550 = c [celule / ml] * 10 8 / k.
Țevi în TBC pot fi înlocuite cu HEPES sau BES. Aceasta va duce doar la o ușoară scădere a competenței. Eficiența transformării este practic constantă în intervalul de pH de 5,6-7,0, dar la pH> 7,0 precipită MnCl2.
DMSO în concentrații mari este toxic pentru bacterii (acest lucru nu permite pasa sterilitatea), deci se adaugă la celule în două faze. Mai mult, este bine să se adauge, astfel încât să se evite orice zone „concentrație ridicată“ (dar tipchika final cufundat în suspensia de celule nu poate fi - DMSO va îngheța și înfunda tip). Fie în picături, cu agitare constantă, sau de a pune pe (unde freeze DMSO) răcit peretele tubului, din care se clătește, amestecând tub.
Tubul trebuie să fie din material plastic, utilizarea unui tub de sticlă poate reduce eficiența cu aproximativ 10 ori (aparent datorită adsorbției ADN-ului la sticlă).
Înghețarea în azot lichid (șoc rece) crește competența de 4-5 ori.
Influența dimensiunii plasmidului asupra eficienței transformării: frecvența molară este practic constantă pentru dimensiuni
Șoc termic: temperatura poate fi în intervalul 40-50 o C.
Există un raport potrivit căruia dacă șocul termic este înlocuit cu "înghețarea în azot lichid (1 '), dezghețarea (înainte de NT)", atunci competența va crește
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: