Există un grup mare de substanțe care inhibă sinteza ADN, ARN sau proteine. Unele dintre ele au găsit aplicații în medicină pentru tratamentul bolilor infecțioase și a bolilor tumorale, în timp ce altele sunt pentru persoana cea mai puternică toxină. Acestea din urmă includ toadstoolul a-amanitină, care este un inhibitor al ARN polimerazelor eucariote.
Efectul inhibitorilor biosintezei matricei ca medicament se bazează pe:
modificarea matricelor (ADN sau ARN);
aparate pentru sintetizarea proteinelor (ribozomi);
Locul central printre ele aparține antibioticelor - diverse în structura chimică a compușilor organici sintetizați de microorganisme. Informațiile scurte privind antibioticele care inhibă sinteza matricei sunt prezentate în Tabelul 7.2.
Antibiotice - biosinteza matricei inhibitoare
Utilizarea tehnologiei ADN în medicină
Avansurile în biologia moleculară au influențat în mod semnificativ medicina modernă: nu numai că au aprofundat cunoștințele despre cauzele multor boli, dar au contribuit și la dezvoltarea de noi abordări în diagnosticul și tratamentul lor.
Pentru a detecta defectele în structura ADN, trebuie izolat de materialul biologic și "copiat" (dezvoltat) în cantități suficiente pentru studiu. Pentru terapia genică, este necesar să se izoleze genele normale și să se introducă în celule defecte astfel încât acestea să fie exprimate, permițând restaurarea sănătății pacientului.
Extracția ADN implică liza celulară rapidă, îndepărtarea fragmentelor de organele și membrane celulare prin centrifugare, degradarea proteinelor prin proteaze, extracția ADN-ului cu precipitarea ulterioară. În timpul izolării, se obțin molecule foarte mari, acestea fiind fragmentate în continuare prin enzime de restricție. Fragmentele rezultate sunt separate prin electroforeză. Numărul și lungimea fragmentelor rezultate și, în consecință, localizarea benzilor pe electrophograma este unică și specifică pentru fiecare persoană.
Identificarea secvențelor caracteristice se realizează prin hibridizarea Southern blot. Fragmentele ADN sunt supuse denaturării și transferării (blotting) la un purtător dens (filtru sau membrană). ADN-ul fixat pe filtru este hibridizat cu mici fragmente de ADN sau ARN conținând o etichetă radioactivă (fluorescentă sau altă). Astfel de fragmente se numesc sonde de ADN sau ARN. Dacă există secvențe în proba de testare care sunt complementare secvențelor de sondă, hibridizarea poate fi determinată vizual sau cu ajutorul unor instrumente speciale. Metoda este utilizată pentru a diagnostica bolile infecțioase, defectele ereditare, pentru a stabili expresia anumitor gene.
Sequencing (determinarea structurii primare) a ADN-ului se efectuează prin metoda chimică sau enzimatică. Metoda lui Maskam și Gilbert (chimic) se bazează pe degradarea chimică a ADN-ului. Esența metodei este după cum urmează: un capăt al fragmentului ADN este marcat cu o etichetă radioactivă sau fluorescentă. Preparatul ADN marcat este împărțit în patru porțiuni și fiecare dintre acestea este tratat cu un reactiv care distruge una sau două din cele patru baze, condițiile de reacție fiind selectate astfel încât sunt necesare doar câteva leziuni pe molecula ADN. Ca rezultat, se obține un set de fragmente marcate, ale căror lungimi sunt determinate de distanța de la baza distrusă până la capătul moleculei. Fragmentele formate în toate cele patru reacții sunt supuse la electroforeză în patru benzi adiacente; apoi conduceți identificarea acestora. Prin poziția amprentelor, puteți stabili la ce distanță de la capătul etichetat a fost baza distrusă și cunoașteți această bază - poziția acesteia. Astfel, setul de benzi determină secvența de nucleotide a ADN-ului.
Metoda Sanger (enzimatică) se bazează pe modelarea reacției ADN polimerazei, în care molecula ADN care este studiată este folosită ca șablon. Se adaugă dideoxinucleotide la amestecul de reacție (nu există nici o grupare OH în poziția 3 'a pentozelor). ADN polimeraza include aceste precursori în ADN. Cu toate acestea, atunci când sunt încorporate în ADN, nucleotida modificată nu poate forma o legătură fosfodiesterică cu următoarea deoxiribonucleotidă. Ca urmare, alungirea acestui lanț se oprește la locul unde dideoxiribonucleotida a intrat în ADN. Reacția se desfășoară simultan în patru eprubete separate, fiecare conținând una din cele patru dideoxinucleotide și toate cele 4 trifosfați de deoxinucleotide (de obicei, se atașează o etichetă radioactivă sau fluorescentă). În fiecare dintre tuburi se formează un set de fragmente marcate de diferite lungimi. Lungimea lor depinde de locul unde nucleul defect este inclus în lanț. Fragmentele de ADN marcate obținute sunt separate într-un gel de poliacrilamidă cu o precizie de un nucleotid, se realizează identificarea și se stabilește o secvență nucleotidică a ADN-ului în patru probe din structura distribuției fragmentelor.
Prepararea ADN-ului recombinant și amplificarea acestuia. În producerea ADN-ului recombinant, aceste molecule sunt izolate din două surse diferite. Fiecare dintre ele este fragmentată separat folosind aceeași enzimă de restricție. După procedeul de încălzire și răcire lentă a amestecului fragmentelor obținute, împreună cu moleculele originale de ADN, se formează ADN-uri recombinante, constând din secțiuni ADN aparținând inițial unor probe diferite. Folosind tehnica ADN-ului recombinant, este posibil sa studiem variantele genelor responsabile pentru dezvoltarea multor boli. În acest fel, pot fi identificate diverse mutații.
Clonarea ADN-ului este realizată pentru a obține cantități semnificative de material genetic recombinat. care implică inserarea fragmentului ADN dorit într-o moleculă vectorică, vectorul asigură penetrarea acestui ADN recombinant în celulele bacteriene. Atunci când bacteriile transformate se înmulțesc, crește numărul de copii ale fragmentului ADN inserat, precum și sinteza produselor proteice, care nu sunt caracteristice celulei bacteriene, dar sunt foarte valoroase pentru ființele umane. Vaccinurile, insulina, hormonul de creștere, factorii de coagulare etc. sunt obținuți în acest mod.
Lucrul cu secvențele nucleotidice necesită o cantitate suficientă de material pentru a fi studiată. Prin urmare, fragmentele ADN sunt pre-amplificate (crește cantitatea). Metoda de reacție în lanț a polimerazei (PCR). propusă în 1983 de Curry Mullis, permite ca orice mostră de ADN specific să fie supusă amplificării specifice în condiții in vitro.
Reacția în lanț a polimerazei are loc în trei etape:
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: