După ce ADN-ul este cusut într-un tub de testare, acesta trebuie multiplicat, adică clona. Scop: obținerea de copii multiple ale genelor dorite. Pentru a clona fragmente mici de ADN, se folosesc plasmide sau ADN fag, pentru cele mari - cosmide și cromozomi artificiali.
Există două abordări ale clonării ADN-ului:
1) utilizarea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru a multiplica ADN-ul străin introdus în ele.
2) amplificarea ADN in vitro.
Folosind microorganisme, pot fi create două tipuri de biblioteci de ADN: genomică și clonală (bibliotecă cADN).
Biblioteca genomică (banca genetică, clonoteca) este o colecție de clone ADN, incluzând toate fragmentele care sunt incluse în genomul acestei specii. Adică, banca genetică poate fi numită în continuare un set de fragmente clonate ale genomului. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.
Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.
Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Este mai bine să utilizați fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.
Pentru a crea o bancă de gene, aveți nevoie de:
1) izolarea întregului ADN genomic
2) fragmentarea ADN-ului prin enzime de restricție sau ultrasunete
3) Molecule circulatorii ADN purificate (vectori) sunt tratați cu aceeași enzimă de restricție, obținându-se ADN liniar. ADN-ul celular este adăugat la plasmidă în prezența ligazelor. În acest fel, un ADN plasmidic recombinant
4) recDNA este introdusă în celule bacteriene sau de drojdie, unde plasmidul replică pentru a forma multe copii.
5) Bacterii de clonare: fiecare colonie de celule emergente este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide formează o bibliotecă de ADN genomic.
Dezavantajul. fragmentele de ADN se formează în cantități imense. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.
Demnitate: biblioteca de gene poate fi stocată și folosită pe o perioadă nedeterminată.
-material sursă pentru studierea structurii, funcției și reglementării genelor individuale, structura și funcția proteinelor
-conservarea genotipului speciilor pe cale de dispariție
Colecții similare obținute din cromozomi individuali sau din părți ale acestora se numesc biblioteci cromozomiale.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: