Capitolul 5 tehnologia hibridă

CAPITOLUL 5 TEHNOLOGIA HYBRIDOMA. ANTIBODIILE MONOCLONALE

La sfârșitul anilor 60 - începutul anilor 70 ai secolului XX. Au fost dezvoltate metode de laborator pentru clonarea celulelor in vitro. Pentru a face acest lucru, creați mediul de cultură necesare, materiale pentru sticlărie de laborator și termostate incubatoare, care a permis pentru a simula condițiile de mediul intern al organismului de a menține viabilitatea celulelor de mamifere. În termen de 10-12 ani, a reusit sa clona numai celulele tumorale din cauza capacității lor de a deține proprietate este nelimitată (în condiții externe favorabile pentru ei) se împarte la mitoza. G. Keller și C. Milstein în 1974-1975. Am folosit metoda de producere a celulelor somatice hibride, care a fost utilizat pentru studiul localizare citogenetică a genelor care controlează o indicație particular într-un anumit cromozom (celule hibride emit cele mai multe dintre cromozomi, dar nu toate), la limfocite, dar și în alte scopuri. G. Keller și C. Milstein au primit celule hibride din tumoarea limfoidă (mielom) și limfocite normale. Celulele hibride au fost o parte a cromozomului (și, prin urmare proprietățile) unei limfocite normale (cealaltă parte este expulzat din cromozomii celulelor pentru prima divizie, genomul nu este încă stabilizat) și o porțiune - a tumorii. Numai celulele care au moștenit mielomul din diviziune nelimitată s-au înmulțit. În paralel, acestea au fost biosinteza diferitelor produse limfocitare normale, de exemplu, anticorpi; Acestea din urmă erau solicitate de G. Keller și C. Milstein. Celulele care separă nelimitat au permis "să se cloneze", adică fizic "sămânță" una câte una (fiecare într-un vas separat) și obțineți clone de celule - descendenți ai unei celule. Astfel de celule se numesc hibridoame.

Limfocitele de hibridizare a fost preparat din splina sau ganglionii limfatici anterior imunizați cu antigenul de șoareci (mai des - linia Balb / c). Ca tumora kletokpartnerov utilizează crescute special pentru celulele de mielom de șoarece mutant de hibridom (uneori numită plasmocitom, că, în acest caz, la fel) obținut din linia de celule de mielom transplantat MOPC-21 de la șoareci Balb / c

menținute în cultură in vitro 1921 G. Keller și Milstein, folosind celule de mielom mutante citogenetică derivate anterior, de asemenea, pentru producerea de celule de mamifere hibride, dar pentru alte scopuri: pentru celulele hibride arunca cea mai mare parte a cromozomului pe citogenetică rămase localizarea ajustată a anumitor gene priznakkodiruyuschih în cromozomi specifici.

O suspensie de celule limfoide din șoarecii imune sunt amestecate într-un tub de testare într-un volum minim de mediu cu o suspensie de celule de mielom timp de 1-2 minute și a adăugat agent fuzioneaza. Keller și Milstein La început, acest agent a fost la fel ca în cytogeneticists, virusul Sendai, dar după câteva luni au toate „gibridomschiki“ ca agent de coalescență utilizat polimeri sintetici, - polietilenglicoli cu greutăți moleculare de la 1540 la 6000 D. După 1-2 min suspensie de celule care conține un amestec de celule limfoide netopite, mielom nefuzionate celule hibride 3 variante de celule ( „limfocite-limfocite“, „mielom-mielom“, „limfocite mielom“, dintre care celulele căutate sunt doar hibrizi „limfocite mielom“), spălat și diluat în volumul calculat al mediului selectiv al HAT. NAT înseamnă "hipoxantină-aminopterină timidină". Aceste 3 componente sunt introduse în mediul de cultură complet la concentrații cunoscute. In primele 7-10 zile de cultură, amestecul menționat de celule în cultură, se întâmplă următoarele:

1) limfocitele care nu se estompează și hibrizii "limfocite-limfocite" mor din cauza fragilității lor naturale;

2) celule de mielom nefuzionate și hibride „mielom-mielom“ mor din cauza incapacității sale de a efectua biosinteza ADN în prezența aminopterină - otravă metabolice,

blocarea selectivă enzime biosintetice de novo bazele pirimidinice ale N5 N10-metilen-tetrahidrofolat; biosinteza bazelor purinice hipoxantina în aceste celule este de asemenea imposibilă datorită lipsei GGFRT; 3) singurele celule care sunt capabile să supraviețuiască în medii HAT este de dorit, „limfocite mielom“ celule hibride: biosinteza bazelor purinice au furnizat gena GGFRT care este derivat din limfocite normale și hipoxantină mediului și biosinteza bazelor pirimidinice se efectuează sredovye timidin participarea timidin-kinazei. Principalele etape ale tehnologiei hibride sunt prezentate în Fig. 5.1. Din celula de celule hibride date mielom moștenesc proprietatea de proliferare nelimitată. De la limfocitele B normale imunitar - biosinteza de imunoglobuline.

Proliferarea "non-stop" permite clonarea celulelor hibride, i. E. disipați câte 1 per godeu și așteptați ca această clonă să crească din această singură celulă în condiții favorabile de cultură. multe celule identice (până la mutații spontane). Care dintre care rezultă celulele hibride „limfocite mielom“ produc anticorpi ridicat, constata, selectarea din godeurile corespunzătoare mostre de teste imunologice supernatant. Mai târziu, selectat hibridom rekloniruyut și repetat în cultura redată în masă - reactoare in tumori in vitro sau ascita la șoareci singenici. Din supernatante de cultură sau fluide de ascită izolate anticorp monoclonal hibridomul într-o formă purificată.

Dacă o clonă de celule de hibridom sintetizează anticorpi, atunci acești anticorpi se numesc monoclonali. Experiența a demonstrat că toate celulele hibridom donate anticorpi sintetiza același - și specificitatea sitului activ și izotipul lanțului greu, adică anticorpii monoclonali nu sunt doar un produs monoclonal, ci și un preparat de imunoglobuline identice. La sfârșitul anilor 1970 ne-au cultivat in vitro și celulele T clonate, nu a trecut cu o linie de celule tumorale. Acest lucru a devenit posibil numai după descoperirea factorului de creștere al limfocitelor T, denumit mai târziu IL-2. Ea clonarea subpopulații T-limfocite au dus la descoperirea de limfocite T CD4 + și pentru a face multe alte descoperiri, inclusiv identificarea HIV (suficient pentru a studia numarul de gene si proteine ​​ale virusului ar putea dovedi

numai pe limfocitele T cultivate in vitro în prezența factorilor de creștere). Limfocite B, fără a le transforma în hibridome pot fi făcute pentru a partaja (care le permite să fie clonate) atunci când infectarea lor cu virusul Epstein-Barr (se transforma B-limfocite normale in tumora de limfocite B).

Astfel, anticorpii monoclonali produși de o singură clonă sunt:

• foarte specific, îndreptat spre un determinant determinant antigenic;

• identice în izotip, alotip și idiot, precum și în caracteristicile afinității și fizico-chimice.

Culturile hibridoma stabile sunt capabile să producă un număr nelimitat de anticorpi monoclonali.

Anticorpii monoclonali sunt acum utilizați pe scară largă în diverse domenii ale medicinei. Utilizarea mAb-urilor în diverse domenii se bazează pe posibilitatea obținerii unor cantități mari de anticorpi cu afinitate ridicată specifice:

1) la antigenii imunogeni care determină histocompatibilitatea și diferențierea;

2) Diferențierea, neoplazice și alte antigene de suprafață celulară care sunt lipsite de polimorfism și non-imunogen în sistemele alogenice, dar sunt recunoscute imunizare când xenogeneic;

3) antigeni virali și bacterieni;

4) determinanți singulari antigenici ai diferitelor proteine, acizi nucleici și zaharuri.

Utilizarea mAb permite definirea și separa o subpopulație de celule care disting etapă individuală dezvoltarea celulelor, mai precis tastate tesut identifica mai precis microorganismele precum și determinarea mai fiabile a metodelor imunologice macromoleculele biologice importante.

un număr mare de sisteme de diagnosticarea diferitelor boli dezvoltate în medicina bazată pe Mab (boli infectioase, cancer si altele.). Activ dezvoltat și medicamente pe bază de Mab, de exemplu, medicamente anticanceroase, anticorpi anti-citochine (medicament remikeyt et al.) Cu toate acestea, sa demonstrat că utilizarea mAb murin pentru imunoterapia bolilor neoplazice dă naștere la efecte secundare diferite și diferite acțiuni de eficiență slabă.

Modificarea murine mAb (anticorp umanizat conjugati mAb și înaltă. - radionuclizii, droguri, toxine etc.) deschide noi posibilități în diagnosticul și tratamentul cancerului și a altor boli.

Articole similare

• Tehnologia mineritului de aur

• Tehnologie caramida zidarie ziduri caracteristici, metode, izolare (video)

• Încălzirea fundației din interiorul și din exteriorul tehnologiei turnate, schema

Trimiteți-le prietenilor: