Știința metodelor de fotometrie a fluxurilor de radiații optice în funcție de lungimea de undă se numește spectrofotometrie. Aceasta include fotometria, spectrometria și metrologia.
Măsurătorile fotometrice, cum ar fi factorul de transmisie sau coeficientul de reflexie sunt relativ simple și se bazează pe faptul că fasciculul de lumină incidente injectat probă și transporta fluxul a trecut prin (sau reflectată de acesta, respectiv), la fluxul de incident în absența probei.
Cu reflecție difuză sau transmisie, este necesar să se colecteze toate razele împrăștiate în direcții diferite. În acest caz, o minge fotometrică integrată, având o suprafață interioară albă difuză difuză, este adesea utilizată pentru măsurarea coeficienților de transmisie și reflexie.
Bile similare sunt utilizate pentru a măsura fluxul de lumină de la sursa de radiație (sursa de radiații este plasat în interiorul minge). Ideea experimentului este că iluminarea creată de multiplele reflexii din interiorul mingii este uniform distribuită pe suprafața sa interioară și este direct proporțională cu fluxul total de lumină. Dacă orice punct al suprafeței interioare a bilei este protejat de lovirea directă a razelor de la sursă, iluminarea sa va fi direct proporțională cu fluxul luminos total. Efectuând măsurători alternativ cu eșantionul de referință și investigat în raport cu iluminările obținute, este posibil să se calculeze fluxul de lumină din sursa de referință.
Spectrometria include o varietate de dispozitive spectrale care fac parte din spectrofotometru.
În general, în spectrofotometru include: sursa de radiații optice, aparatul pentru furnizarea intervalelor necesare spectrale (monocromator sau un set de filtre), un fotodetector și sistemul de detectare a semnalului. Sistemul de înregistrare poate fi un singur canal (de obicei, construit pe baza monocromator, în care scanarea se realizează prin rotirea rețelei de difracție sau prismă) sau multi-canal (scan nu este aplicat și un număr discret de lungimi de undă în polychromator sau porțiuni ale spectrului continuu în spectrografelor sunt înregistrate simultan). În toate spectrofotometrele seriale moderne, un monochromator este plasat între sursa de lumină și eșantion pentru a minimiza acțiunea fotochimică a radiației de măsurare.
Atunci când se măsoară spectrele de absorbție, se obțin curbele în mod obișnuit pe care se trasează axa valurilor sau numărul de valuri de-a lungul axei abscise, iar ordonata este transparența sau densitatea optică.
Unul dintre factorii importanți în eliminarea erorilor în măsurătorile spectrofotometrice este alegerea domeniului de valori al semnalului măsurat. Deoarece două semnale sunt comparate pentru a determina transparența, densitatea optică sau transmisia, este important ca diferența lor să depășească în mod semnificativ nivelul de zgomot.
Pentru determinarea corectă a valorilor D și T, este foarte important să se țină cont de efectul luminii reflectate și împrăștiate de eșantion și de elementele aparatului. În plus, receptorul de lungimea de undă măsurată a radiației este întotdeauna într-un fel sau altul, se reflectă sau împrăștiate radiații a componentelor dispozitivului optic de altă lungime de undă (de obicei, un maxim al sursei de lumină). Nivelul minim al luminii dispersate au spectrofotometrele echipate cu dublu monocromator, în special cu dispozitiv de dispersie combinat-grilaj prismă (tip Shimadzu mod. UV-365). Cu toate acestea, nu ar trebui să fim flatate de capacitățile pasaportului ridicat ale dispozitivelor (cele mai moderne se caracterizează printr-o gamă de densități optice de până la D = 5). În cazul în care nu sunt luate toate măsurile pentru a minimiza impactul unei laturi (împrăștiate), lumina a trecut de monocromator la acele lungimi de undă în cazul în care obiectul în studiu nu absoarbe, valorile măsurate ale densității optice și transparența ar putea fi mai departe de adevăr.
Fracția de lumină împrăștiată (i) devine deosebit de mare în acea gamă spectrală de măsurători în care sensibilitatea fotodetectorului este mică sau luminozitatea sursei și este cea mai pronunțată atunci când se înregistrează benzi de absorbție intense. În același timp, densitatea optică măsurată D B regB este mai mică decât valoarea reală D:
Distribuția luminii în volumul și pe suprafața probelor studiate, precum și fotoluminescența lor, introduc distorsiuni suplimentare în spectrele de absorbție observate. Distribuția luminii de către proba conduce la o distorsionare a formei spectrelor și la o determinare incorectă a densității optice.
Măsurarea spectrelor luminescenței
Spre deosebire de spectroscopia fluorescentă prin alte tehnici spectroscopice constă în faptul că dependența spectrală înregistrată este o funcție de două variabile - excitație lungime de undă l B ExB și lungimea de undă de emisie l B EMB. Dacă l B ExB menținut constant, și l B EMB scanate, spectrul măsurat fluorescența I (l B EMB) (dependența spectrală a intensității emisiei fluorescente a lungimii de undă). Dacă l B exB este scanat pentru o constantă l B emB. obținut spectrul de fluorescență de excitație I (l B EXB) (dependența spectrală a eficienței de fluorescență de excitație la lungimea de undă). În ilustrarea grafică a spectrelor de emisie (sau excitație) fluorescenței pe axa orizontală reprezintă lungimea de undă (în nanometri) sau numărul de undă (în cm P -1 P), iar axa ordonatei - intensitatea fluorescenței I B FLB (în unități arbitrare). Dacă absorbția optică a luminii este suficient de mică și distribuția spectrală a luminii excitant este considerat corect, spectrul de excitație este similar ca formă spectrul de absorbție.
În soluțiile lichide ale moleculelor organice individuale, de regulă, forma spectrului de emisie de fluorescență nu depinde de lungimea de undă de excitație. Forma benzii spectrului real de fluorescență al unei soluții moleculare este în majoritatea cazurilor oglindă-simetrică cu cea mai lungă bandă de absorbție a lungimii de undă. De regulă, aceste benzi se suprapun între ele într-un anumit interval spectral.
Atunci când sunt excitate la cea mai lungă lungime de undă a spectrului de absorbție, spectrele de fluorescență ale soluțiilor moleculare solide suferă deplasări.
Spectrofluorimetrele sunt utilizate pentru a studia distribuția spectrală a luminii emise de eșantion. Pe aceste instrumente este de asemenea posibil să se măsoare schimbările în intensitatea emisiei ca funcție a lungimii de undă de excitație (spectre de excitație a fluorescenței).
Spectrofluorimetrul constă din următoarele dispozitive principale: o sursă de lumină incitantă; dispozitive pentru izolarea intervalelor spectrale ale excitației luminiscente și detectarea lor (în cele mai universale dispozitive, acestea sunt monocromatore); fotodetector cu sistem electronic de înregistrare a semnalelor.
Transmisia monochromatorilor și sensibilitatea fotodetectoarelor depind de lungimea de undă. Prin urmare, pentru a obține distribuția reală a intensităților relative în spectrele de fluorescență a curentului măsurat în funcție de lungimea de undă a celulei fotoelectrice trebuie reglată la funcția de calibrare (sensibilitatea spectrală a aparatului). În caz contrar, distribuțiile spectrale măsurate nu vor corespunde spectrelor fluorescente reale. Majoritatea spectrofluorimetrelor moderne corectează spectrele în mod automat. Spectrele obținute pe diferite instrumente, în orice caz, nu poate fi comparat, în cazul în care nu există nici o certitudine că acestea sunt ajustate la sensibilitatea spectrală a aparatului.
Spectrofluorimetrie particularitate este că emisia de fluorescență se produce în volumul interior al eșantionului este izotrop și se răspândește în toate direcțiile (în unghiul solid plin de 4 p). Condiții de colectare a acestei radiații pe o celulă fotoelectrică și o formă geometrică a modelelor afectează puternic intensitatea spectrelor de fluorescență detectată. Violarea condițiilor de izotropie în calea sau proba optică poate duce la o schimbare a formei lor spectrale.
Fluorescența este o metodă extrem de sensibilă. Prin urmare, distorsiunile puternice ale spectrelor pot fi cauzate de împrăștierea luminii în probă și / sau de prezența unor cantități chiar mici de impurități în ea. Impuritățile pot conduce atât la distorsiunea adevăratelor dependențe spectrale prin contribuția luminiscenței lor, cât și la scăderea intensității luminiscenței până la stingerea completă. Orice compensare pentru aceste efecte sau contabilizarea lor pentru măsurători ale probelor de referință care nu conțin compusul luminesc supus anchetei nu este posibilă.
Chiar și în absența factorilor distorsionanți, dependențele spectrale măsurate experimental nu corespund întotdeauna spectrului real de fluorescență. Intensitatea lor poate depinde de schema geometrică a detecției fluorescenței în raport cu direcția fasciculului luminos incitant.
Dacă densitatea optică a probei de testare este mică (D <0,1), то интенсивность флуоресценции одинакова в любой точке вдоль пути возбуждающего света через образец. При увеличении оптической поглощательной способности образца интенсивность флуоресценции, регистрируемой под прямым углом, вначале растет, затем ее рост постепенно замедляется и, наконец, падает, поскольку флуоресценция почти перестаёт проходить сквозь основной объем образца. При этом флуоресцирует лишь часть образца, прилегающая к поверхности на которую падает возбуждающее излучение. Регистрация флуоресценции с этой поверхности (регистрация "на отражение") позволяет проводить измерения и в таких условиях. При регистрации "на отражение" наблюдается насыщение роста интенсивности флуоресценции с ростом концентрации флуоресцирующих молекул.
Acest comportament al fluorescenței, împreună cu geometria experimentului, se datorează două efecte: absorbția luminii excitante și a luminii fluorescenței intrinseci în cea mai mare parte a eșantionului. Primul efect este numit efectul filtrului intern, iar cel de-al doilea se numește reabsorbție sau absorbție secundară. Să le discutăm în detaliu.
Efectul filtrului intern este observat la densități optice ridicate și constă în faptul că intensitatea luminii incitante din volumul eșantionului îndepărtat de sursa de lumină este mai mică decât în volumul cel mai apropiat de sursă. Straturile frontale ale eșantionului acționează ca un filtru care absoarbe cea mai mare parte a luminii incitante. Iluminarea eșantionului devine neuniformă, iar intensitatea luminiscenței scade. La concentrații foarte mari, lumina excitantă este absorbită aproape complet, iar fluorescența poate fi observată numai de pe un strat subțire de suprafață. Forma spectrului de fluorescență nu poate fi distorsionată dacă densitatea optică este suficient de mică în regiunea suprapusă a spectrelor de absorbție și fluorescență sau suprapunerea este nesemnificativă. Efectul filtrului intern poate fi cauzat de orice componente absorbante de lumină ale probei, inclusiv solventul (baza polimerică) și impuritățile. Distorsiunile formei spectrelor de fluorescență datorate filtrului intern vor fi observate dacă absorbția acestor componente se află în regiunea spectrală a fluorescenței studiate.
Dacă absorbția și suprapunerea spectrelor de fluorescență și densitatea optică a probei în zona de suprapunere este mare, absorbția observată a fluorescenței intrinseci a luminii de către componenta fluorescentă - reabsorbtia sau absorbție secundară. Efectul reabsorbtia, împreună cu o scădere a intensității fluorescenței, conduce întotdeauna la o denaturare a forma spectrelor. În acest caz, simetria oglindă a spectrelor de absorbție și fluorescență este încălcată. Acest lucru se datorează faptului că reabsorbția cauzează o denaturare a spectrului de fluorescență în mod exclusiv în regiunea de suprapunere cu spectrul de absorbție. Ca urmare a acestor distorsiuni treptat odată cu creșterea densității optice a probei în domeniu (de exemplu, prin creșterea concentrației componentului fluorescent) dispare de unde scurte (pentru mai multe fosforescente care au permis structura vibratorie) o parte a spectrului de fluorescență. Distorsiunile devin mai mari, cu atât densitatea optică a componentei fluorescente este mai mare în regiunea suprapusă a spectrelor. In cele din urma, spectrul de fluorescență adevărată este o coadă cu lungime de undă lungă structură, dispusă în mod substanțial în afara regiunii de absorbție intrinsecă a componentei fluorescente. maximă spectrală a formării poate fi zeci structură, de nanometri relativ părtinitoare poziția maximă a spectrului adevărat.
Fenomenul reabsorbtie datorită atât proprietățile substanței fluorescente și caracteristicile metodologice de măsurare a fluorescenței. După cum sa menționat mai sus, randamentul cuantic luminiscență este întotdeauna mai mică decât unitatea și o porțiune de lumină absorbită de molecula este consumată nonradiatively. Aceasta înseamnă că, cu fiecare act de absorbție secundară a unui intensitate foton fluorescenta emisia de fluorescență este redusă în continuare. Pe de altă parte, într-un mediu izotrop, moleculele emit fluorescență într-un unghi solid complet de 4 p. În timp ce posibilitățile tehnice fluorometre permit colectarea luminii pe un fotodetector într-un unghi solid cu o soluție de 30 P 0 P P -40 P. despre care este de numai aproximativ 10% din emisiile totale. Având în vedere unghiul de colectare a luminii și faptul că fiecare secundar a absorbit un foton de molecula luminiscență emite în domeniul de aplicare a intensității integrate determinată de randamentul cuantic, este ușor de observat că mai mult de zece ori redusă cu emisie secundară a fiecărui eveniment înregistrat intensitatea fluorescenței.
modificări aparente în forma spectrelor și schimburi spectrale datorită efectului trivială reabsorbtia cercetător nesofisticat poate fi bine interpretat datorită modificărilor structurale din eșantion. De exemplu, exprimarea reabsorbție poate fi interpretată ca acumularea de fluorescență sensibilizat ca rezultat al transferului de energie de la donator la acceptor sau eronat atribuite formării de excimers. Prin urmare, trebuie amintit întotdeauna că intensitatea distorsiunii și formei spectrului de fluorescență a benzilor este neglijabilă numai atunci când densitatea optică a eșantionului în regiunea de suprapunere a spectrului de absorbție al componentei fluorescente cu spectrul emisiei sale (este posibil să numim acest număr „grosime optică“ a probei) nu depășește în timpul măsurătorilor de fluorescență valori de 0,01-0,05. La astfel de densități optice, efectul filtrului intern practic nu este manifestat. Cerințe pentru acest factor pentru impurități nu este atât de greu, dacă doriți să măsoare numai forma spectrelor de fluorescență, nu intensitatea lor și absorbția impurităților trece aproape de banda fluorescenta. La măsurarea randamentului cuantic al luminiscenței, este necesară o indemnizație pentru factorul de impuritate.
După cum vedem, măsurarea corectă a spectrelor luminescente este posibilă numai la densități optice scăzute. Densitatea optică necesară poate fi selectată prin scăderea concentrației componentei luminescente în imagine sau prin reducerea grosimii stratului. Cu toate acestea, în ultimul caz, nu este întotdeauna posibilă eliminarea manifestării reabsorbției. În straturile subțiri de soluții (grosime de 1 mm) cu densitate optică de ordinul 0,04, efectul de reabsorbție a fost clar observat. Eliminarea reflecției interne totale a redus efectul doar la jumătate. Cel mai bun efect a fost obținut prin limitarea dimensiunilor transversale ale fasciculului incitant. În acest caz, s-a observat o scădere de 10 ori a contribuției de reabsorbție, practic proporțională cu o scădere a zonei de excitație. Acest fenomen poate fi explicat prin reabsorbția în vrac a propagării fluorescenței de-a lungul stratului absorbant (în direcția perpendiculară pe fasciculul incitant). Cu o scădere a grosimii stratului, rolul reabsorbției crește datorită reflexiei interne totale.
1. Ce se numește spectrofotometrie?
2. Cum se efectuează determinarea coeficientului de transmisie și reflexie direcțională?
3. Descrieți lucrarea de integrare a bilelor fotometrice.
4. Ce este inclus în spectrofotometru?
5. Ce trebuie luat în considerare atunci când se determină corect densitatea optică și transparența mediului?
6. Care este diferența dintre spectroscopia fluorescentă și alte metode spectrale?
7. Care sunt elementele principale ale unui spectrofluorimetru?
8. Care este efectul filtrului intern?
Trimiteți-le prietenilor: