Metode de inactivare a virusului. Metode chimice de inactivare a virusului.
În producția industrială de medicamente virale cu viteză tot mai mare, sunt implicați agenți virale mai noi și mai noi. Marea majoritate a obiectelor noi aparțin clasei așa-numitelor "virusuri shell". Există o tendință de reducere rapidă a perioadei dintre descoperirea unui alt agent patogen și organizarea producției de laborator și industriale a medicamentelor inactive.
Cerințele de siguranță sunt înăsprite datorită necesității de a obține mai multe cazuri de preparare a concentratelor de antigen viral. Trebuie remarcat faptul că inactivarea trebuie să fie nu numai eficientă, ci și cât mai blândă posibil (selectivă). Cu alte cuvinte, modificările însoțitoare ale structurii particulelor virale și ale componentelor acestora trebuie să fie minime. Cu toate acestea, mecanismul de inactivare a impactului este, în multe privințe, insuficient clarificat, iar utilizarea sa este adesea de natură empirică.
Deoarece virionii sunt în centrul agregatelor formate de componentele celulare și serice. pot fi protejate împotriva inactivării, distrugerii și îndepărtării agregatelor prin diverse metode de purificare a suspensiei de virus este o etapă importantă înainte de inactivare. Fabricarea de vaccinuri non-replicatoare cu virion întreg utilizează metode chimice și fizice pentru a inactiva virușii.
Metode chimice pentru inactivarea virusilor
Dintre compușii chimici, cele mai des folosite sunt două tipuri principale de inactivatori: agenți de reticulare (agenți de dezintegrare) și agenți de alchilare.
Agenții reticulați includ aldehide, incluzând formaldehidă, glutaraldehidă și glicidaldehidă, din care se utilizează cel mai des formaldehidă. Agenții de alchilare includ betapropiolactona, etilenimina și alte aziridine.
Mecanismul de acțiune al agenților de inactivare. probabil, constă în următoarele: 1) interacționează cu acizi nucleici, fac imposibilă replicarea lor; 2) determină reticularea proteinelor.
Mecanismul de acțiune al agenților de inactivare este mai bine studiat cu privire la proteine decât la acizii nucleici, deși, în general, rămâne neclar. Virusul inactivat pare să se bazeze pe acțiunea dublă a reticulării proteinelor care interacționează cu receptorii celulari și a blocării replicării acizilor nucleici. Concentrația necesară a agenților de inactivare depinde în principal de concentrația relativă a proteinelor și a acizilor nucleici în mediul inactivat. Temperatura și omogenitatea substratului inactivat joacă, de asemenea, un rol-cheie în cinetica inactivării virusului.
Trebuie luată în considerare posibilitatea reversibilității modificărilor în grupurile reactive (grupul amino al lizinei, nucleele fenolice ale tirozinei), în special atunci când se utilizează formaldehidă.
Completitudinea inactivării virusului trebuie determinată imediat după fabricarea vaccinului.
Cele mai frecvente agenți de inactivare sunt formaldehida, beta-propiolactona și etilenimina. Unul dintre beneficiile de beta-propiolactonă utilizate pentru fabricarea unui vaccin împotriva rabiei, etileneimină și utilizate la fabricarea de vaccin împotriva febrei aftoase, este că acestea sunt complet hidrolizat în termen de câteva ore pentru a forma produse non-toxice.
Formaldehida inactivează virusurile datorită reactivității sale ridicate în ceea ce privește proteinele și acizii nucleici. Intră într-o legătură nu numai cu particulele de virus, ci și cu numeroasele componente ale mediului în care sunt adăugate.
Mecanismul de inactivare a virusurilor cu formaldehidă este complex și se caracterizează prin două tipuri de reacții. Interacțiunea formaldehidei cu acidul nucleic și proteinele virusului se desfășoară, respectiv, în funcție de tipul reacției dintre prima și a doua ordine. Cel mai important pentru inactivare este primul, care, totuși, depinde în mare măsură de cel de-al doilea.
Interacționând cu acizii nucleici și proteinele, formaldehida reacționează în principal cu grupările amino. Adăugarea de formaldehidă la grupele amino ale purinelor și pirimidinei distruge matricea și activitatea informațională a acizilor nucleici.
Formaldehida interacționează mai rapid cu grupele amino ale aminoacizilor și proteinelor pentru a forma derivați de metil, decât cu bazele azot ale acizilor nucleici. A existat o noțiune că formaldehida reacționează cu proteinele și acizii nucleici ai virusurilor în două etape. Inițial, ca rezultat al interacțiunii dintre formaldehidă cu o grupare amino sau imino, format derivatul metiolol foarte repede instabil, apoi, ca rezultat al reacțiilor secundare - derivați de bismetilenovye.
Produsele de reacție ale formaldehidei cu aminoacizi sunt capabile să reacționeze cu acizii nucleici mult mai rapid decât formaldehida în sine.
În a doua etapă, produsele de reacție primare interacționează lent cu alte grupe de proteine, ducând la formarea de dimeri legați covalent ai polipeptidelor. În același timp, plicul proteic devine mai dens și permeabilitatea acestuia scade. Ca o consecință, rata de inactivare a virusului este redusă. Sub influența formaldehidei în virionii de encefalită transmisă de căpușe, s-au format dimeri de glicoproteină și un complex de ARN cu proteine nucleocapside. Acesta din urmă era foarte stabil și distrus numai de RNase. Se presupune că formarea acestui complex este mecanismul principal de inactivare a virusului. Glicoproteina extrasă din virusul inactivat a avut activitate normală antigenică și imunogenă.
Trebuie remarcat faptul că reacția formaldehidei cu grupările amino este reversibilă, adică dacă excesul de reactiv este îndepărtat sau soluția este diluată, activitatea acidului nucleic poate fi restabilită. Procesul de interacțiune a virusului cu formaldehida depinde de factori cum ar fi concentrația reactivului, temperatura, pH-ul mediului.
În condiții optime de inactivare, interacțiunea formaldehidei cu proteinele multor virusuri nu afectează în mod semnificativ proprietățile lor antigenice. Cu toate acestea, un număr de viruși pierd o cantitate semnificativă de activitate antigenică atunci când formalinul este inactivat. Acest lucru este valabil mai ales pentru virușii de coajă și, mai presus de toate, virusurile rujeolei și sincițialului respirator (PC). De exemplu, un vaccin PC-virus inactivat cu formalină a determinat formarea de anticorpi la proteina F care nu a inhibat activitatea sa de formare infecțioasă și simplast. Mai mult, vaccinarea a dus la complicarea cursului bolii la apariția ei ulterioară. Probabil, sub acțiunea formalinei, epitopii glicoproteinei, responsabili de inducerea anticorpilor de neutralizare a virusului, se schimbă.
Aceasta se referă, înainte de toate, la proteina de suprafață F responsabilă pentru imunitatea protectoare. Cu toate acestea, mulți dintre virușii care tolerează relativ bine inactivarea formalinului sunt foarte sensibili la schimbările în condițiile sale. Creșterea concentrației de formaldehidă este de zece ori sau mai mult comparativ cu optimul (0,1%) conduce la modificări morfologice ale antigenului de suprafață al virusului hepatitei B și o scădere a activității sale, în timp ce o creștere a timpului de procesare a capsida poliovirusul purificată însoțită de o deteriorare semnificativă a unor virioni. Pentru a atenua efectul dăunător al formaldehidei asupra antigenicității și imunogenității virusurilor, au început să se utilizeze substanțe de stabilizare. S-au găsit, de exemplu, că arildona plus (5.4 M) nu a afectat tulpini de inactivare atenuate și virulente de poliovirus cu formalină (1: 4000, 37 ° C) și, în același timp, ajută la păstrarea imunogenitate prin stabilizarea D-antigen.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: