Metode de microscopie a preparatelor histologice

METODE DE MICROSCOPIE A PREPARATELOR HISTOLOGICE

METODE DE MICROSCOPIE A PREPARATELOR HISTOLOGICE

Principala metodă de studiere a microobiectelor biologice este microscopia luminii și a electronilor, care sunt utilizate pe scară largă în practica experimentală și clinică.







Microscopie de lumină. Pentru a studia microobiectele histologice, se folosesc microscoapele convenționale de lumină și varietățile lor, în care se utilizează surse luminoase cu valuri de diferite lungimi. În microscoapele convenționale de lumină, sursa de iluminare este lumina naturală sau artificială (Figura 2.1). Lungimea de undă minimă a părții vizibile a spectrului este de aproximativ 0,4 μm. Prin urmare, pentru un microscop de lumină convențional, distanța cea mai mică rezolvată este de aproximativ 0,2 μm, iar mărirea totală (produsul măririi lentilelor prin mărirea ocularului) poate fi 1500-2500.

Astfel, folosind un microscop de lumină, puteți vedea nu numai celule individuale care măsoară între 4 și 150 microni, ci și structurile lor intracelulare - organele, incluziunile. Pentru a spori contrastul microobiectelor aplicați culoarea lor.

Microscopie ultravioletă. Acesta este un fel de microscopie ușoară. În microscopul ultraviolet, se folosesc raze ultraviolete mai scurte cu o lungime de undă de aproximativ 0,2 pm. Distanța distanțată este de 2 ori mai mică decât în ​​cazul microscoapelor convenționale de lumină și este de aproximativ 0,1 μm. Obținută în razele ultraviolete, imaginea invizibilă pentru ochi este transformată în imaginea vizibilă prin înregistrarea pe o placă fotografică sau prin utilizarea unor dispozitive speciale (un ecran fluorescent, un convertor optic cu electroni).

Fluorescentă (fluorescentă) microscopie. Fenomenele de fluorescență constau în faptul că atomii și moleculele unui număr de substanțe,

Metode de microscopie a preparatelor histologice

Fig. 2.1. Microscoape pentru cercetare biologică:

3 - un dispozitiv de scanare pentru deplasarea unui fascicul de lumină de-a lungul axelor X, Y, Z;

4 - sistem de alimentare cu energie electrică și rack de control cu ​​laser; 5 - computer pentru procesarea imaginilor

razele de undă, intrați într-o stare excitată. Trecerea inversă de la starea excitat la starea normală are loc cu emisia de lumină, dar cu o lungime de undă mai lungă. Microscopul cu fluorescență ca surse de lumină folosită pentru a excita fluorescenta sau mercur KCE, presiune ultraînaltă nonovye având o luminozitate ridicată în domeniul spectral 0.25-0.4 microni (langa razele ultraviolete) și 0,4-0,5 microni (albastru - raze virale). lungimea de undă a fluorescenței este întotdeauna mai mare decât lungimea de undă a luminii de excitație, astfel încât acestea sunt separate prin filtre și a studiat imaginea unui obiect numai în lumina fluorescenta. Distingeți fluorescența proprie sau primară și indusă sau secundară. Orice celulă a unui organism viu are fluorescență proprie, dar este adesea extrem de slabă.

fluorescenta primar poseda serotonina, catecolamine (epinefrină, norepinefrină) conținute în nerv, grăsime și alte celule, țesuturi după fixare în vapori de formaldehidă la 60-80 ° C (metoda Falk).

Fluorescența secundară apare atunci când se prepară preparate cu coloranți specifici - fluorochromi.

Există diferite fluorocromatici care se leagă în mod specific la anumite macromolecule (orange acridina, rodamină, fluoresceină și altele.). De exemplu, în timpul manipulării produselor de ADN cu orange acridină și compușii acestuia în celulele sunt luminoase verzi și ARN și derivați ai acestora - o strălucire roșie strălucitoare. Există mai multe vopsele care pot fi folosite pentru a identifica proteine, lipide, calciu intracelular, magneziu și sodiu. Astfel, compoziția spectrală a radiației poartă informația despre structura internă a obiectului și compoziției sale chimice. Metoda Opțiunea de microscopie de fluorescență, în care atât excitația și emisia de fluorescență are loc în regiunea ultraviolet a spectrului, numita metoda de microscopie de fluorescență în ultraviolet.

Pentru a crește contrastul obiectelor fluorochromice, se utilizează o versiune confocală a microscopului optic (vezi Figura 2.1, c). Ca lumină, este folosit un fascicul de lumină monocromatică cu diametru mic, care creează o sursă de laser. La fiecare punct din punctul de foc al microscopului este o zonă mică (volum) a celulei. Fasciculul de lumină se deplasează prin obiect (scanează obiectul de-a lungul axelor X, Y, Z). Fiecare fascicul de lumină este deplasată de către una dintre liniile de scanare se obține informații despre structura investigată, situat la un moment dat (ecran) în conformitate cu linia de scanare (o tăietură celulă optică), cum ar fi localizarea proteinelor constând din microtubulilor într-o celulă. Toate informațiile primite de la fiecare punct de scanare celulară sunt transferate pe computer, combinate cu un program special și afișate pe monitor ca imagine de contrast. Cu această metodă microscopie obține informații cu privire la forma de celule, citoscheletului, cei care structura de bază, cromozomi etc Folosind un program de calculator bazat pe primite pentru fiecare linie de scanare de informații generează imaginea volumetrică a celulei, permițând celulei privite din unghiuri diferite.







Phase contrast microscopy. Această metodă servește pentru a obține imagini contrastante ale obiectelor vii transparente și incolore care sunt invizibile în metodele convenționale de microscopie. Metoda se bazează pe faptul că lumina, care trece prin structuri cu un indice de refracție diferit, își schimbă viteza. Designul utilizat al opticii microscopului face posibilă transformarea modificărilor de fază a luminii care trece prin preparatul nevopsit în modificări ale amplitudinii sale, adică luminozitatea imaginii rezultate, care nu este percepută de ochi. Metoda de contrast de fază asigură contrastul structurilor nevăzute studiate datorită unei diafragme inelare speciale plasate în condensator și a așa-numitei plăci de fază situate în lentilă. O variantă a metodei de contrast de fază este metoda de contrast de câmp întunecat, care dă o imagine negativă în comparație cu contrastul de fază pozitivă.

Microscopie într-un câmp întunecat. Într-un microscop cu câmp întunecat, numai lumina care dă structuri de difracție (înfășurând de valuri) în preparat atinge obiectivul. Aceasta se datorează prezenței în microscop a unui condensator special, care iluminează preparatul cu o lumină strict oblică; Razele de la iluminator sunt trimise din lateral. Astfel, câmpul pare întunecat, iar particulele fine din preparat reflectă lumina care intră apoi în obiectiv. In clinica, metoda este utilizată pentru studiul cristalelor in urina (acid uric, oxalat), pentru a demonstra spirochete, în special Treponema pallidum, cauzând sifilis, etc.

Microscopie de interferență. Soiurile microscopului cu contrast de fază sunt un microscop de interferență, destinat determinării cantitative a masei tisulare. Microscopul cu interferență diferențială (cu optica Nomarsky) este folosit pentru a studia relieful de suprafață al celulelor și al altor obiecte biologice.

Într-un microscop de interferență, o rază de lumină de la un iluminator este împărțită în două fluxuri: una trece prin obiect și schimbă în faza oscilației, al doilea trece ocolind obiectul. În prismele lentilei, ambele fascicule sunt suprapuse pe ele. Ca rezultat, se construiește o imagine în care secțiunile unui microobiect de diferite grosimi și densități diferă în funcție de gradul de contrast. După cuantificarea modificărilor, se determină concentrația și masa substanței uscate.

Polarizare microscopie. Un microscop polarizant este o modificare a microscopului luminii, în care filtrul de polarizare două montat: un prim (polarizor) - între grinda și fasciculul obiect și al doilea (analizorul) - între lentila obiectiv și ochi. Prin primul filtru, lumina se deplasează numai într-o direcție, al doilea filtru are o axă majoră,

care este perpendiculară la primul filtru și nu transmite lumină. Se pare efectul unui câmp întunecat. Structurile care conțin molecule orientate longitudinal (colagen, microtubuli, microfilamente) și structuri de cristal, au proprietatea de a roti axa razele de lumină care emană din polarizator. Atunci când se schimbă axa de rotație, aceste structuri apar ca fiind strălucitoare pe fundalul întunecat. Capacitatea cristalelor sau a formărilor paracristaline de a bifurca un val de lumină într-un val obișnuit și perpendicular pe el se numește birefringență. Această abilitate este posedată de fibrile de mușchi striate.

Electron microscopie. Un important pas înainte în dezvoltarea tehnicilor de microscopie a fost crearea și aplicarea unui microscop electronic (a se vedea figura 2.1). Microscopul electronic utilizează un flux de electroni cu valuri mai scurte decât într-un microscop luminos. La o tensiune de 50.000 V, lungimea de undă a oscilațiilor electromagnetice produse de mișcarea fasciculului de electroni într-un vid este de 0,0056 nm. Se calculează teoretic că distanța rezolvată în aceste condiții poate fi de aproximativ 0,002 nm sau 0,000002 pm, adică de 100 000 de ori mai mică decât într-un microscop luminos. Practic, în microscoape electronice moderne, distanța care trebuie rezolvată este de aproximativ 0,1-0,7 nm.

În histologie, se folosesc microscoape electronice de transmisie (translucentă) (TEM), microscoape electronice de scanare (raster) (SEM) și modificările lor. Cu ajutorul TEM, se poate obține doar o imagine plană a microobiectului studiat. Pentru a obține o reprezentare spațială a structurilor, sunt utilizate SEM capabile să creeze o imagine tridimensională. Microscopul electronic de scanare funcționează în conformitate cu principiul scanării unui obiect de către un microprob cu electroni, adică testează punctele individuale ale suprafeței cu un fascicul de electroni focalizat puternic. O astfel de investigație a unui obiect se numește scanare (citire), iar modelul de-a lungul căruia se mișcă microproba este raster. Imaginea rezultată este afișată pe un ecran de televiziune, a cărui fascicul de electroni se mișcă sincron cu microproba.

Principalele avantaje ale microscopiei electronice de scanare sunt adâncimea mare a câmpului, o gamă largă de modificări de mărire continuă (de la zeci la zeci de mii de ori) și rezoluție înaltă. Versiunile moderne ale instrumentelor pentru studierea suprafeței unui obiect sunt un microscop de forță atomică și un microscop de scanare tunel.

Microscopia electronică utilizând metoda de înghețare este utilizată pentru a studia detaliile structurii membranelor și conexiunilor intercelulare. Pentru a face chips-uri, celulele sunt înghețate la o temperatură scăzută (-160 ° C). La examinarea membranei, planul de scindare trece prin mijlocul lipidelor bilaterale. Metalele (platină, paladiu, uraniu) sunt apoi pulverizate pe suprafețele interioare ale jumătăților de membrană obținute și studiate cu TEM și micrograf.

Metoda de microscopie crioelectronică. Un strat subțire congelat rapid (aproximativ 100 nm) al probei de țesut este plasat pe microscop și examinat într-un vid al microscopului la -160 ° C.

Metoda de microscopie electronică "înghețare-gravură" este folosită pentru a studia suprafața exterioară a membranelor celulare. După o înghețare rapidă a celulelor la o temperatură foarte scăzută, blocul este împărțit cu o lamă de cuțit. Cristalele de gheață rezultate sunt îndepărtate prin sublimarea apei în vid. Apoi secțiunile celulelor sunt umbrite prin pulverizarea unui film subțire de metal greu (de exemplu, platină). Metoda permite identificarea organizării tridimensionale a structurilor.

Astfel, metodele de înghețare și de înghețare-gravare permit studierea celulelor nefixate fără formarea de artefacte în ele, cauzate de fixare.

Metodele de contrast cu sărurile metalelor grele fac posibilă studierea într-un microscop electronic a macromoleculelor individuale - ADN, proteine ​​mari (de exemplu miozina). Când se contractează negativ, sunt studiate agregatele de macromolecule (ribozomi, viruși) sau filamente de proteine ​​(filamente de actină).

Microscopia electronică a secțiunilor ultrascurte obținute prin metoda cryo-ultramicro-tomium. În această metodă, bucăți de țesut fără fixare și turnare în mediu solid sunt răcite rapid în azot lichid la o temperatură de -196 ° C Aceasta asigură inhibarea proceselor metabolice ale celulelor și trecerea apei din faza lichidă în faza solidă. Alte blocuri sunt tăiate pe ultramicrotom la temperatură scăzută. Această metodă de preparare a secțiunilor este de obicei utilizată pentru determinarea activității enzimelor, precum și pentru realizarea reacțiilor imunochimice. Pentru a identifica antigeni, s-au folosit anticorpi asociați cu particule de aur coloidale, a căror localizare este ușor de identificat pentru medicamente.

Metode de microscopie de înaltă tensiune. Se folosesc microscoape electronice cu o tensiune de accelerație de până la 3.000.000 V. Avantajul acestor microscoape este acela că permit studierii obiectelor cu o grosime mare (1-10 μm), deoarece la o energie de electron ridicat ele sunt mai puțin absorbite de obiect. Analiza stereoscopică oferă informații despre organizarea tridimensională a structurilor intracelulare cu o rezoluție înaltă (aproximativ 0,5 nm).







Trimiteți-le prietenilor: