Clonarea ADN-ului, misterele științei, lumea invizibilă

Clonarea ADN este utilizarea tehnologiei ADN recombinant pentru izolarea și replicarea unei secvențe specifice de nucleotide conținute într-un amestec complex de fragmente de ADN. În acest scop, inițial toate fragmentele ADN ale amestecului sunt inserate în vectorul de clonare. apoi, prin screening, moleculele recombinante care conțin fragmentul ADN dorit sunt selectate, de exemplu. gena. și apoi înmulțirea acestora prin introducerea ADN-ului recombinant selectat într-o celulă gazdă adecvată, de ex. în cușca Escherichia coli.

Clonarea ADN implică 6 etape:

1) obținerea de fragmente de ADN, incluzând gene sau părți ale acestora, prin enzime de restricție;

2) recombinarea fragmentelor,

3) introducerea unui fragment ADN într-un vector;

4) transformarea cu vectorul organismului gazdă;

5) screening pentru un vector recombinant

6) selectarea cercetătorilor de clonă interesați.

Enzime de restricție. Restricție. Endonucleazei.

În fiecare cromozom uman există o singură linie continuă de ADN. Este dificil de ambalat pentru a se încadra în cromozom. Este practic imposibil să se manipuleze cu o moleculă de ADN de această lungime.

Prin urmare, descoperirea în anii 70 ai secolului XX. enzime bacteriene specifice. taierea ADN-ului în fragmente separate, a fost foarte utilă. Enzimele au fost denumite enzime de restricție sau endonucleaze.

În bacterii, aceste enzime servesc pentru a proteja împotriva introducerii în celulă a ADN străin. În mod tipic, enzimele de restricție recunosc așa-numitele secvențe palindromice de nucleotide, observate în două catene de ADN și constând din 4-6 nucleotide.

Ingineria genetică

Metode pentru donarea ADN-ului

După ce ADN-ul este cusut într-un tub de testare, acesta trebuie multiplicat.

Există două abordări ale clonării ADN-ului. Prima abordare implică utilizarea celulelor bacteriene sau de drojdie pentru a multiplica ADN-ul străin introdus în ele. A doua metodă este amplificarea ADN in vitro.

Clonarea ADN-ului in vivo

Folosind microorganisme, puteți crea două tipuri de biblioteci ADN: genomice și clone.

Biblioteca genomică. Dacă genomul oricărui organism este tăiat, introdus în vectori plasmidici sau virali și inserat în celulă, atunci în această formă poate fi conservat. Atunci când se taie plasmidul sau ADN-ul fagului, probabilitatea de a pierde bucăți întregi și neschimbate ale genomului este destul de mare.

Această metodă de obținere a unei biblioteci genomice a fost numită "metoda cu pistol", deoarece genomul în acest caz este reprezentat de fragmente separate.

Principiile de creare a vectorilor plasmidici și virali sunt obișnuiți, deci luați-le în considerare utilizând exemplul de plasmide. Trebuie remarcat faptul că este mai bine să se folosească fagi ADN din ADN viral, deoarece acestea au o capacitate mare și permit introducerea unor bucăți mai mari din genom.

Molecula circulară ADN purificată este digerată cu o enzimă de restricție pentru a obține ADN liniar. ADN-ul celular este tratat cu aceeași enzimă de restricție, adăugată la plasmidă, se adaugă ligaze. Astfel, se obține un ADN plasmidic recombinant, care este introdus în celule bacteriene sau de drojdie. Plasmidul replică cu formarea multor copii. Multe plasmide poartă o genă pentru rezistența la antibiotice și dacă există o astfel de genă într-o plasmidă recombinantă, atunci celulele pot fi ușor detectate prin creșterea pe un mediu antibiotic.

Fiecare astfel de colonie este o clonă sau descendență a unei singure celule. Plasmidele unei colonii conțin o clonă de ADN genomic, iar agregatul de plasmide poate fi numit o bibliotecă de ADN genomic. Dezavantajul acestei metode este că fragmentele ADN se formează într-o cantitate enormă. Tăierea ADN-ului genomic este determinată de caz, deci doar o fracțiune din fragmente conțin gene valoroase. Unele fragmente pot conține numai o parte din secvențele genei sau intronului.

CDNA bibliotecă. Crearea ADNc începe cu sinteza pe template-ul ARN folosind transcriptaza inversă a catenei complementare a ADN-ului. Se creează apoi condiții alcaline, lanțul ARN este defalcat în nucleotide, după care se sintetizează o lanț ADN complementar utilizând ADN polimeraza. În același timp, se formează un fragment ADN cu capete bont. Un astfel de ADN este inserat în plasmide și introdus în celulele bacteriene. Atunci când plasmida este amplificată, se formează o clonă a unei copii complementare a ADN-ului.

Avantajele ADN-ului clonat în fața clonelor de ADN genomic sunt că proteina care codifică secvența nucleotidică a genei nu este întreruptă.

Gene genele genunchi conțin introni care trebuie să fie îndepărtați din ARN-ul transcripției înainte de a-l converti într-un ARN de matrice, urmat de splicing. Celulele bacteriene nu pot efectua o astfel de modificare a ARN, formată prin transcrierea genei unei celule eucariote. Prin urmare, dacă se dorește obținerea de proteine prin exprimarea unei gene clonate, este mai bine să se utilizeze o bancă cADN derivată din ARN matriceal.

ligatura Restriktsiya-

În tehnicile clasice de restricție și ligare, donarea unui fragment de ADN implică patru etape: tăierea ADN-ului cu endonucleaze de restricție. ligarea ADN-ului cu un vector. transfecția și screening-ul ulterior.

Selectarea unei inserții

Inițial, este necesar să se izoleze un sit ADN pentru clonare. Deseori, un preparat de ADN pentru clonare este obținut prin reacția în lanț a polimerazei. și, de asemenea, tăierea ADN-ului prin enzime de restricție. prelucrarea ADN-ului prin ultrasunete. fracționată prin electroforeză de ADN de agaroză. Izolarea insertului se poate face prin tehnologia de clonare a shotganului, un ADN complementar. sinteza chimică artificială.

transformare

După ligare, plasmida este transformată în bacterii pentru creștere. Bacteriile sunt în continuare cultivate într-un mediu selectiv pentru a selecta colonii care conțin inserția. Coloniile individuale sunt selectate și studiate pentru prezența unei instalații.

transfecție

După ligare, amestecul de reacție cu vectorul inserat în orientarea dorită este plasat în celule. În funcție de tipul celular, se utilizează sensibilizarea celulelor chimice, electroporația sau tunurile genetice. Pentru sensibilizarea chimică nu este necesar un echipament special. Electroporația este utilizată atunci când este necesară o eficiență ridicată a transfecției. Pistoalele genetice sunt folosite în cazul celulelor și țesuturilor din plante, deoarece peretele celular al plantelor nu permite ADN-ului străin să intre în citoplasmă și nucleu.

Sunt obținute culturi de celule transfectate. Deoarece procedurile descrise mai sus au deseori eficiență scăzută, sunt necesare metode pentru a identifica celulele care conțin inserția dorită în orientarea corectă și pentru a separa astfel de celule de inserțiile neinserate. Vectorii de clonare moderni conțin markeri selectivi care permit doar creșterea celulelor cu inserția corectă să crească pe un mediu selectiv. Vectorii pentru clonare de asemenea conțin adesea markeri care provoacă colorarea coloniilor, de exemplu atunci când sunt crescuți pe un mediu care conține X-gal. Pentru o confirmare corectă a clonării cu succes, este necesară o verificare utilizând o reacție în lanț a polimerazei. polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție sau al secvențierii ADN.

Terapie genetică