Cultivarea microorganismelor
Pentru cultivarea cu succes a microorganismelor este importantă nu numai selectarea corectă a mediului nutritiv și însămânțarea adecvată, ci și crearea condițiilor optime: asigurarea temperaturii, umidității și aerării adecvate. De regulă, cultivarea cu succes a microorganismelor în laborator este posibilă numai dacă condițiile mediului înconjurător pentru ele sunt reproduse cu atenție.
Temperatura optimă pentru cultivarea majorității agenților patogeni pentru microorganismele cu sânge cald (inclusiv uman) (37 de grade) este creată în termostat.
Termostatul este un dispozitiv cu pereți dubli, între care se află aer sau apă. Apa este încălzită cu ajutorul unui curent electric. Termostatul este prevăzut cu un termostat care menține automat temperatura dorită și un termometru pentru controlul temperaturii.
Tuburile de testare cu culturi sunt instalate în trepied pe rafturile termostatului. Paharele din termostat trebuie să stea cu capul în jos.
Pentru a permite ca aerul din termostat să circule liber și încălzirea să fie uniformă, rafturile din termostat sunt făcute cu decupaje și nu se încarcă dens în timpul funcționării.
Pentru a nu răci culturile, termostatul nu este lăsat deschis pentru o perioadă lungă de timp.
Când cultivați în medii nutritive lichide, nu există nici o problemă de menținere a umidității.
Proaspat agar mediu conține întotdeauna o anumită cantitate de picurare - apă lichidă. Este de remarcat sub forma unui condens mai mult sau mai puțin abundent, însă depozitarea pe termen lung a culturilor pe medii solide la temperatura camerei sau chiar mediu refrigerat seacă, ceea ce poate duce la moartea microorganismelor. Prin urmare, este necesar să se facă în timp util subculturi regulate culturi, evitând medii de uscare. Dacă aveți de gând cultivarea pe termen lung într-un incubator, plăcile sau tuburile sunt plasate cel mai bine într-o cameră umedă, adică, într-un vas închis, în cazul în care există un rezervor de apă. Unele ciuperci se pot dezvolta pe substraturi solide, fără picurare - mediul lichid, dar într-o atmosferă umedă.
În ziua însămânțării, mediile nutritive dense, pe bază de agar-agar, se topesc într-o baie de apă și se varsă în stare lichidă în vase Petri. După ce agarul s-a solidificat și apa de condensare este uscată într-un termostat, este posibil să se semene un agar de plăci. Coacerea mediilor nutritive dense în tuburile de testare este, de asemenea, mai bună în ziua însămânțării. Atunci când se cultivă microbi care sunt deosebit de sensibili la absența umidității (de exemplu, gonococi), un vas deschis cu apă este plasat în termostat.
Majoritatea covârșitoare a microbilor, inclusiv a celor patogeni, nu necesită lumină. Lumina directă a soarelui afectează în mod negativ dezvoltarea multor microorganisme, astfel încât acestea sunt cultivate în termostate luminoase. Cu toate acestea, pentru a studia formarea pigmentului, care apare mai activ în lumina difuză, culturile după termostat sunt menținute timp de 2-3 zile sub iluminare în încăpere.
Microorganismele care utilizează energie luminoasă în procesele metabolice sunt cultivate în iluminare. Pentru iluminat, sunt de obicei folosite lămpi incandescente cu o putere de 75 până la 100 wați. În cultivarea algelor pot fi folosite și lămpi fluorescente.
Cele mai multe bacterii patogene sunt cultivate 18 - 24 de ore, dar există tipuri de dezvoltare mult mai rapid (Vibrio cholerae 8 - 10 ore) sau mai lent (Brucella 5 - 27 zile, tubercul bacili 4 - 6 săptămâni etc.).
Durata cultivării microorganismelor depinde de viteza de reproducere a acestora. Pentru a menține umezeala în eprubetele în timpul cultivării prelungite a microbilor, dopurile de bumbac după însămânțare se înlocuiesc cu cauciuc steril sau se pun capace de cauciuc pe ele.
Conform nevoilor microbi in oxigen liber divizat în aerobi obligatorii ai (agenți cauzatori de holera, ciuma, tuberculoza), anaerobe (activatori tetanosul, botulismul, infecția plăgii gaz, Bacteroides) și bacteriile anaerobe facultativi (patogeni tifoidă, dizenterie, Staphylococcus și altele.). Aceste grupuri necesită condiții de cultură diferite.
La cultivarea aerobilor și a anaerobelor facultative, oxigenul necesar este furnizat prin aerare pasivă și activă.
aerare pasivă - cultivarea de microorganisme pe medii nutritive lichide și solide, închis cu un tampon de bumbac sau bumbac - dopuri de tifon, precum și pe un mediu nutritiv solid în vase Petri. În acest caz, microorganismele se dezvolta pe suprafața mediului și oxigen se obține direct din tubul de aer sau capsula Petri. Prin urmare, atunci când microorganismele de cultură de suprafață încerca să mărească aria de contact a mediului cu aer. Pentru a face acest lucru, se toarnă un strat subțire de mediu în vas cu fund largă (vase Petri, flacoane Vinogradski, saltele).
Pe medii lichide, microorganismele aerobe cresc sub formă de filme, de obicei destul de dense. Anaerobii facultativi se dezvoltă și în grosimea mediului lichid, formând o ceață mai mult sau mai puțin uniformă sau fulgi. Acestea sunt caracterizate de filme mai puțin dense decât pentru aerobii obligați.
Cultivarea suprafeței microorganismelor este utilizată în laboratoare și în industrie.
Aerarea activă este folosită pentru cultivarea profundă a microbilor, atunci când acestea sunt cultivate în volume mari de mediu. Pentru a furniza suficientă cantitate de oxigen pentru aceste culturi, ele sunt plasate în scaune speciale - amestecarea constantă a culturii asigură contactul cu aerul. Când se cultivă microbii în volume lichide care ating zeci și sute de litri, se folosesc dispozitive numite reactoare sau fermentatoare. Aerul este suflat prin cultura prin dispozitive speciale.
Cultivarea anaerobelor este mai complicată decât aerobii, deoarece trebuie să fie privați de aer liber cu oxigen. În acest scop, aerul este îndepărtat din mediul de cultură folosind o varietate de metode:
1. Eliminarea oxigenului prin mijloace mecanice. Microorganismele anaerobe pot fi cultivate în vase Petri convenționale prin plasarea lor imediat după însămânțare într-un anaerob, de unde este apoi evacuat aerul. Anaerostatele sunt aspiratoare metalice sau de sticlă. Anaerostatele metalice au un capac etanșat ermetic și sunt echipate cu un manometru. Ei sunt capabili să mențină descărcări mari pentru o perioadă lungă de timp. Desicatoarele de sticlă în vid au un capac de sol cu o macara pe secțiuni pentru evacuarea aerului. Suprafețele lustruite ale desicatorului sunt acoperite cu un lubrifiant special în vid pentru a evita penetrarea aerului în el.
2. Înlocuirea aerului în anaerostat cu azot, argon, hidrogen sau un amestec de azot și dioxid de carbon.
3. Cultivarea într-o coloană înaltă de agar cu glucoză. Prin această metodă, microorganismele cresc pe fund, protejate de aer printr-un strat superior de mediu.
4. Îndepărtarea oxigenului prin mijloace chimice se realizează prin oxidarea diferitelor substanțe cu ajutorul oxigenului conținut în mediu și a vaselor pentru cultivare.
5. Metoda Vinyal-Veyon este aceea că cultura este produsă într-un tub de testat, topit și răcit la 45 de grade de agar. Conținutul tubului se amestecă și se toarnă într-o pipetă Pasteur folosind o pere, umplând pipeta la vârf. Trebuie să vă asigurați că nici o bule de aer nu intră în pipetă. Capătul subțire al pipetă este sigilat și pipeta este plasată într-un termostat. În grosimea agarului, coloniile izolate de anaerobe cresc.
6. Adăugarea în mediu a substanțelor de reducere (oxidare). Mediul Kitt-Tarozzi care conține 0,5% soluție de glucoză, bucăți de ficat sau de albus de ou se utilizează ca substanțe reducătoare. Înainte de însămânțare, mediul este fiert timp de 20 de minute într-o baie de apă pentru a elimina oxigenul dizolvat din acesta. Înainte de inoculare, uleiul steril este turnat pe suprafața mediului nutritiv cu un strat de 0,5-1,0 cm pentru a proteja anaerobii de penetrarea oxigenului.
7. Metoda biologică a Fortner. Într-un vas Petri, se toarnă un strat gros de agar cu sânge de 5%. Pentru a se asigura că culturile nu se amestecă, diametrul paharului este realizat cu o canelură în agar. O jumătate din mediul nutritiv este plantat cu aerobi, iar celălalt - cu anaerobi. Marginile paharului sunt umplute cu parafină. Culturile sunt plasate într-un termostat. În primul rând, aerobii cresc și, după absorbția oxigenului din ceașcă, se vor dezvolta anaerobi.
Cultivarea actinomicitelor, fungiilor, micoplasmelor, formelor L, spirochetelor și protozoarelor este fundamental similară cu cultivarea bacteriilor. Pentru ei au fost dezvoltate medii speciale și au fost selectate regimuri adaptate nevoilor lor.
Pe tipuri de alimente, ciupercile sunt heterotrofe. Ca sursă de carbon, ciupercile pot folosi majoritatea substanțelor organice. Cu toate acestea, unii ciuperci folosesc mai bine glucoză, alții folosesc fructoză sau pentoză. Ca sursă de azot, fungi pot fi utilizați de compuși organici cum ar fi proteine, peptonă, peptide, aminoacizi, săruri de amoniu, nitrați, azot atmosferic. Gama de utilizare a acestor surse de azot în diferite specii de ciuperci nu este aceeași.
Pentru creșterea și durata de viață a ciupercilor minerale necesare. În plus macronutrienti (carbon, oxigen, hidrogen, azot, sulf, fosfor, potasiu, calciu, magneziu, fier), și au nevoie de microelemente (mangan, zinc, cupru, cobalt, nichel, etc.).
Vitaminele joacă un rol important în fiziologia ciupercilor. Nevoia de vitamine în ciuperci depinde de răspunsul la creștere.
Pentru mediile nutritive, cele mai multe ciuperci sunt extrem de pretențioase. Ele cresc bine pe o mare varietate de substraturi: cartofi, morcovi, agar de zahăr, agar de glicerină. Creșterea optimă a ciupercilor are loc la o temperatură de 26-28 grade. În funcție de compoziția mediului nutritiv, caracteristicile caracteristicilor culturale ale unei anumite ciuperci pot varia.
Ciupercile sunt cultivate în scopuri diferite - de a se menține într-o stare viabilă fără pierderi de funcții și trăsături structurale, de a identifica, de a obține produse de metabolism fungic, de a conserva recoltele de semințe etc. Selectarea mediului pentru cultivarea fungiilor depinde de scopul studiului și de caracteristicile biologice ale microorganismului.
Mediu pentru cultivarea ciupercilor asupra compoziției ingredientelor sunt: 1. Natural - o varietate de substraturi de origine vegetală sau animală (rădăcinoase, cereale și semințe, frunze și tulpini de plante, organe de animale și țesuturi).
2. Semisintetice - o combinație de medii din substraturi naturale și componente chimice cunoscute.
3. Sintetice - constând din ingrediente cu compoziție cunoscută. Diferite combinații ale ingredientelor în mediile sintetice și concentrațiile lor nu sunt limitate în mod particular și pot fi utilizate pentru a determina diferite ciuperci procese vitale legate de creșterea lor, reproducerea și activitatea fiziologică.
Pentru actinomicide, cele mai potrivite medii nutritive sunt agarul alcalin al glicerinei, cartofii, zerul, carnea și mediul ascitic, precum și agarul Saburo. Culturile sunt cultivate în condiții aerobe și anaerobe la 35-37 grade timp de cel puțin două săptămâni.
Cultivarea protozoarelor intestinale pe medii nutritive speciale este o metodă biologică de îmbogățire, ceea ce face posibilă obținerea unui număr suficient de paraziți din specimene unice. Creșterea numărului de exemplare ca urmare a înmulțirii acestora pe un mediu nutritiv facilitează detectarea și studiul paraziților.
media folosite pentru cultivarea amoebe intestinale, compus din patru ouă și mediu Locke (1000 ml apă distilată, NaHCOz - 0,2 g, clorură de calciu - 0,2 g, KCl - 0,4g, NaCl - 9,0g, glucoza - 2 , Sr, pH-ul mediului este de 7,4). Pentru a obține o suprafață tivită a mediului, tuburile într-o poziție înclinată sunt plasate într-un aparat de coagulare și menținute la 70 de grade până când sunt solidificate. Înainte de semănat în eprubetă cu mediu nutritiv solid se adaugă câteva picături de ser de cal uman sau inactivate și 1 - 2 bucle bulion orez steril.
Pentru a cultiva steguletele, se adaugă un ou la 200 ml de mediu Locke și amestecul rezultat se încălzește într-o baie de apă timp de 15 minute. Apoi, amestecul se filtrează prin tavă, se distribuie 5-6 ml în tuburi și se sterilizează într-o autoclavă sub presiune timp de 20 minute.
Când balantidiums de cultură poate fi utilizat mediu Frenkel (asparagina 4,0 g, 6,0g amoniu lacticum, fosfat de potasiu 2,0g disubstituiți, 5,0g NaCI, 1000 ml apă distilată). Mediul este sterilizat într-o autoclavă timp de 20 minute la 120 de grade, 1 atm. Apoi, se adaugă ser cal steril la o diluție de 1:10 și 2 până la 3 picături de amidon (pH-ul mediului este de 7,2 până la 7,4).
Cultivarea protozoarelor se efectuează într-un termostat la 37 de grade. Transferurile sunt efectuate în fiecare zi.
Rickettsia, chlamydia și virușii, care sunt paraziți intracelulare stricți, nu sunt complet cultivate pe suporturi nutritive artificiale folosite pentru cultivarea bacteriilor, fungiilor, micoplasmelor și protozoarelor.
Rickettsia are propriul său metabolism, dar este complet dependentă de energie pe țesutul celular, deci rickettsia sunt paraziți intracelulari. În celula gazdă, fiecare specie de rickettsia se înmulțește numai în anumite locuri: în citoplasmă, nucleu sau vacuole de celule. Rickettsii sunt cultivate în păduchii intestin, sacului vitelin de a dezvolta celule pulmonare embrionare de pui albinoși de celule șoareci neperevivaemyh în culturi de țesuturi.
În chlamydia, se observă nu numai dependența energetică față de celula de țesut, dar și activitatea metabolică este slab exprimată. Prin urmare, chlamydia poate fi cultivată numai în sacul de gălbenuș al unui embrion de pui în curs de dezvoltare sau în celule de cultură tisulară.
Cultivarea virușilor se efectuează pentru izolarea și acumularea lor în scopuri de diagnosticare, pentru studiul lor ulterior, pentru obținerea preparatelor biologice, pentru studiul oncogenezei virale și a patogenezei infecțiilor virale.
Virușii sunt paraziți intracelulare stricți și pentru cultivarea lor sunt folosite trei metode (sub control strict):
1) în corpul unui animal sensibil;
2) într-un embrion de pui în curs de dezvoltare;
3) în cultura celulară.
În practica virologică, pentru cultivarea virușilor, se utilizează în cea mai mare parte animale nou-născute, deoarece sunt mai susceptibile la viruși. Această metodă are o aplicare limitată, deoarece virusii au un tropism specific pronunțat.
Embrionii de pui sunt folosiți pentru a cultiva numai anumite virusuri - gripă, herpes, vierme naturale și de maimuță, oreion.
Cel mai frecvent în practica virologică, celulele de cultură de țesut sunt folosite pentru cultivarea virușilor. Aceste celule pot fi împărțite în trei grupe în funcție de numărul de generații viabile:
1. primar;
2. Transplantabile;
3. Semi-transferabile.
Culturile primare includ culturi celulare care nu pot suporta mai mult de 5 până la 10 pasaje. Ele sunt preparate în principal din țesuturi embrionare: țesuturi de rinichi embrionare umane și maimuțe, amnion uman, embrion de pui, embrion de șoarece și rinichi de maimuțe adulte.
Culturile de celule semi-transplant includ culturi de celule diploide derivate din fibroblaste embrionare umane. Aceste celule pot rezista până la 150 de generații, păstrând setul original diploid de cromozomi. Celulele diploide au găsit o aplicare largă în virologie.
Culturile transplantate sunt obținute predominant din celule tumorale de același tip, care se înmulțesc bine in vitro pentru o perioadă lungă de timp. Astfel de celule includ linii originare din carcinomul uman (HeLa, Hep-2, etc.). Principalul avantaj al liniilor transplantate în fața culturii celulare primare este capacitatea lor de a se reproduce în laborator timp de mai multe generații.
Suporturile nutritive sunt necesare pentru cultivarea culturilor celulare de orice tip. Cel mai utilizat mediu a fost 199. Acest mediu include săruri minerale, glucoză, aminoacizi, vitamine, coenzime și multe alte componente. În plus, soluțiile serice și tampon trebuie adăugate la mediul nutritiv pentru a menține un pH stabil. Pentru a preveni contaminarea bacteriană, antibioticele sunt adăugate în mediu.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: