Determinarea sensibilității stafilococilor spp

La evaluarea sensibilității Staphylococcus spp. În primul rând, este necesar să se testeze preparatele care au importanța clinică principală: beta-lactame, macrolide, fluorochinolone, aminoglicozide și vancomicină.

Criterii de interpretare a rezultatelor testului de sensibilitate al Staphylococcus spp. (valorile limită ale diametrului zonelor de inhibare a creșterii și valoarea MIC a ABP) sunt prezentate în Tabelul 14.

Beta-lactamice

Medicamentele de elecție pentru tratamentul infecțiilor stafilococice (cum ar fi cauzate de Staphylococcus aureus, și koagulazanegativnymi stafilococi) sunt antibioticele beta-lactamice, prin urmare, este mai întâi necesar să se determine sensibilitatea stafilococilor la aceste medicamente.

Rezistența la stafilococ la ABP beta-lactam este asociată fie cu producerea beta-lactamazei, fie cu prezența unei alte proteine ​​PSB2a care leagă penicilina. Identificarea și diferențierea acestor două mecanisme de rezistență face posibilă prezicerea fiabilă a activității tuturor antibioticelor beta-lactamice fără a se evalua direct sensibilitatea la fiecare dintre aceste medicamente. În acest caz, este necesar să se ia în considerare următoarele modele:

• Tulpini Staphylococcus spp. mecanismele lipsite de rezistență, sunt sensibile la toate tipurile de beta-lactam ABP.
• Beta-lactamaza (penicilinaza) Staphylococcus spp. capabil să hidrolizeze peniciline naturale și semisintetice, cu excepția oxacilină și meticilina. Sensibilitatea sau rezistența la benzilpenicilină este un indicator al activității amino-, carboxi- și ureidopenicilinelor naturale și semisintetice. Restul beta-lactamice cu potențial activitate antistaphylococcal (penicilinelor antistaphylococcal, cefalosporinelor I, II și IV generații și carbapeneme) rețin activitatea împotriva tulpinilor beta laktamazprodutsiruyuschih.
• Tulpinile de Staphylococcus spp, care posedă PSB2a, sunt rezistente din punct de vedere clinic la toate tipurile de ABP beta-lactamice. Marcajul prezenței PSB2a este rezistența la oxacilină și meticilină. Astfel de tulpini s-au numit în mod istoric stafilococi rezistenți la meticilină (Staphylococcus spp-MRSS rezistent la meticilină). Alți termeni pentru etichetarea unor astfel de tulpini sunt S. aureus rezistent la meticilină MRSA și S.epidermidis MRSE-meticilină rezistentă.
• Meticilino nu este utilizat în prezent în practica clinică și în diagnosticul de laborator, este aproape complet înlocuit oxacilina, respectiv, a inventat termenul „oksatsillinorezistentnost“, care este complet sinonim cu termenul „meticilino“.

Astfel, sensibilitatea Staphylococcus spp. la ABP beta-lactam ar trebui să includă performanța a două teste:

• Determinarea sensibilității la benzilpenicilină sau detectarea producției de beta-lactamază (penicilinază).
• Determinarea sensibilității la oxacilină sau detectarea PSB2a sau a genei codificatoare a acesteia.

Determinarea sensibilității la benzilpenicilină sau detectarea beta-lactamazei (penicilinazei)

Sensibilitatea Staphylococcus spp. la benzilpenicilina este oarecum complicată de faptul că sinteza beta-lactamazelor în acest microorganism este un proces inducabil (producerea enzimei este mărită după contactul cu antibioticul). Prin urmare, utilizând metodele standard de diluție în serie și DDM, este posibil să se obțină rezultate de sensibilitate falsă.

Soluția la această problemă poate fi folosirea metodei de detectare directă a beta-lactamazelor, pe baza utilizării discurilor cu nitrocefrină. Nitrocefina este o cefalosporină cromogenă, care este ușor hidrolizată de toate beta-lactamazele pentru a forma un produs colorat.

test de așteptare

Pentru realizarea studiului, a fost utilizată o ceașcă, pe care sensibilitatea tulpinii de test Staphylococcus spp. la penicilină și / sau oxacilină DDM. Din limitele zonei de inhibare a creșterii în jurul discului cu oxacilină, o mică cantitate de cultură este luată de bucla bacteriologică și aplicată pe un disc pre-umezit cu nitrocelină. Discul este incubat la temperatura camerei timp de până la 1 oră.

Interpretarea rezultatelor

Apariția de colorare roșie indică producerea de beta-lactamaze de către tulpina microorganismului investigat.

Tulpina producătoare de beta-lactamază, este considerat ca fiind rezistent la peniciline naturale și semisintetice (cu excepția oxacilina) indiferent de rezultatele testelor specifice la ALD enumerate.

Determinarea sensibilității la oxacilină

Atunci când se determină sensibilitatea la oxacilină prin metode standard, este necesar să se țină seama de anumite caracteristici:

• pentru prepararea inoculului, este utilizată numai o metodă directă de suspendare a coloniilor;
• Durata incubării până la momentul luării în considerare a rezultatelor determinării sensibilității la oxacilină ar trebui să fie de cel puțin 24 de ore.

Caracteristicile testării DDM

• Trebuie utilizate discuri care conțin 1 pg de oxacilină.
• Când se iau în considerare rezultatele, este necesar să se acorde atenție chiar coloniilor mici de stafilococi mici detectate în zona de inhibare a creșterii.

Caracteristicile testelor prin metode de diluare în serie

• Se recomandă adăugarea de NaCl (până la o concentrație finală de 2%) la mediul nutritiv.

Interpretarea rezultatelor testării stafilococilor la oxacilină

• Tulpinile de stafilococi, rezistente la oxacilină, ar trebui considerate ca rezistente la TOȚI beta-lactam ABP.
• Rezultatele determinării sensibilității stafilococilor la oxacilină și la alte ABP-uri beta-lactamice pot fi contradictorii, iar rezultatele determinării sensibilității la oxacilină sunt decisive.
• Pentru determinarea sensibilității stafilococilor la beta-lactam ABP, cu excepția benzilpenicilinei și oxacilinei, este inadecvată.
• Pentru stafilococi rezistenți la meticilină se caracterizează prin prezența rezistenței asociate la ABP a altor grupuri. Detectarea rezistenței multiple în stafilococi cu sensibilitate la oxacilină necesită studii repetate.
• Trebuie să se acorde atenție diferențelor în ceea ce privește criteriile de rezistență la methicilină pentru S. aureus și stafilococi cu coagulază negativă.
• Când se obțin rezultate îndoielnice, ar trebui folosite metode suplimentare (screening pe agar - metoda este dată mai jos, detectarea directă a genei mecA sau a proteinei PSB2a).

Livrarea rezultatelor studiului și a recomandărilor privind tratamentul la clinicieni

• Când selectați penitsillino- și tulpini sensibile la meticilina de microorganisme stafilococi este considerat a fi sensibil la toate beta-lactamice ABP, ca medicamentele de alegere sunt naturale și aminopenicillin.
• În identificarea producției de beta-lactamază și sensibilitatea la microorganism oxacilină este rezistent la peniciline naturale, amino, carboxi și ureidopenitsillinam dar sensibili la oxacilina, penicilina si cefalosporine ingibitorozaschischennym I - generația II, care sunt medicamentele de alegere în acest caz. Așa cum va fi, de asemenea activi împotriva tulpinilor de date generație cefalosporinele IV și carbapeneme Cu toate acestea avantaj în comparație cu medicamentele de alegere, ei nu posedă.
• La identificarea rezistente la meticilină este considerat a fi rezistent la toate antibioticele beta-lactamice, pentru tratamentul este necesar să se utilizeze medicamente altor grupuri de care sunt considerate droguri de glicopeptide alegere.

Metode suplimentare pentru detectarea rezistenței la meticilină

Metoda cea mai fiabilă pentru detectarea stafilococilor în metitsillinorezistentnsti o determinare directă a prezenței genei mecA prin metode moleculare genetice (reacție în lanț a polimerazei - PCR). În plus, a fost elaborată o metodă comercială pentru detectarea suplimentară a proteinei de legare a penicilinei - PSB2a în reacția de aglutinare.

În același timp, screening-ul pe agar pentru detectarea meticilina este extrem de sensibilă și specifică, ușor de realizat într-un laborator de microbiologie de rutină de muncă, dar poate fi folosit numai pentru tulpinile de S.aureus.

test de așteptare

Pentru screening, se prepară plăci de agar Müller-Hinton conținând 4% NaCI și 6,0 ug / ml oxacilină. Clorura de sodiu este adăugată la mediul nutritiv în cantitatea necesară înainte de autoclavare. Soluția de lucru a oxacilinei se adaugă la mediul nutritiv după autoclavare și răcirea mediului la 45-50 ° C. Pentru a prepara o soluție de lucru de oxacilină, se folosește o substanță din ABP cu activitate cunoscută.

Suspensia microbiană să fie preparate numai prin suspendarea directă a mai multor colonii izolate de același tip aureus crescute pe vas neselectiv cu agar nutritiv în soluție salină sterilă și să aducă la turbiditatea 0,5 McFarland (1,5 x 10 august UFC / ml).

inoculare

Două metode pot fi utilizate pentru a inocula plăcile de agar: utilizând o micropipetă sau folosind un tampon steril de bumbac.

Metoda I (micropipetă)

• pregătește o diluție 1: 100 de inocul standard, care corespunde standardului de turbiditate de 0,5 McFarland, pentru a obține o suspensie bacteriană care conține 1,5 x 10 iunie cfu / ml (de exemplu, se adaugă 0,1 ml de suspensie standard de la 9,9 ml de steril soluție fiziologică);
• Utilizând o micropipetă, aplicați o picătură (10 pl) de suspensie standard diluată pe suprafața agarului cu oxacilină.

Metoda II (folosind un tampon)

• un tampon steril de bumbac este scufundat într-un tub cu o suspensie standardizată (0,5 McFarland), apoi se umple excesul de umiditate împotriva peretelui tubului;
• cultura este aplicată cu un tampon fie pe o suprafață limitată (diametru 10-15 mm), fie pe întreaga suprafață de agar cu oxacilină într-un vas Petri.

Tulpinile S.aureus sunt incubate la 35 ° C timp de 24 de ore, iar stafilococii cu coagulază negativă timp de 48 de ore.

Analiza profitabilității

După incubare, cupele sunt scanate cu atenție în lumina transmisă:

• apariția unei creșteri vizibile a creșterii mai mult de 1 colonie sau voidă la locul culturii înseamnă rezistența acestei tulpini la oxacilină (meticilină);
• În absența creșterii la locul de aplicare a culturii, tulpina de testare este considerată sensibilă la meticilină (oxacilină).
• cu rezultate discutabile, precum și tulpini izolate de la pacienți cu insuficiență clinică și la pacienți cu infecții severe, este necesar să se realizeze un studiu detaliat al definiției MIC la oxacilină și gena mecA.

Controlul calității

• Studiul a fost realizat cu culturile necesare testelor de control al creșterii la Muller-Hinton agar, 4% NaCl fără oxacilina (cultură aplicată precum și pe oxacilină agar).
• În paralel cu tulpinile de control testate, sunt de asemenea testate: S. aureus ATCC 38591 - rezistent; S. aureus ATCC 29213 - sensibil.

Macrolide și lincosamide

Macrolidele și lincosamidele sunt medicamente alternative pentru tratamentul infecțiilor cu stafilococi. Studiul ar trebui să includă:

• Unul dintre reprezentanții macrolidelor cu 14 și 15 membri. Rezistență încrucișată între reprezentanții individuali.
• Clindamycin. Rezistență încrucișată completă între macrolidele cu 16 membri și lincosamidele.

Selecția de medicamente de mai sus este determinată de tiparele de rezistență încrucișată între antibioticele acestor subgrupe.

Chinolone fluorurate

Recent, a existat o creștere a interesului pentru fluorochinolone ca medicament pentru tratamentul infecțiilor stafilococice (în special a pielii și a țesuturilor moi). Noii reprezentanți ai acestui grup ABP (antipnevmokokkovye fluorochinolone -. Levofloxacina, sparfloxacină, moxifloxacină, etc.) posedă activitate sporită împotriva Staphylococcus spp. în comparație cu medicamentele tradiționale. Între subgrupurile de medicamente enumerate nu există o rezistență încrucișată completă. Medicamentele antipnevmokokovie rămân adesea active împotriva tulpinilor rezistente la alte fluorochinolone.

aminoglicozidele

În practică, este necesar să se ia în considerare anumite trăsături ale interpretării rezultatelor obținute in vitro. Astfel, atunci când se detectează rezistența la gentamicină, tulpina izolată trebuie considerată ca fiind rezistentă la toate aminoglicozidele. În acest sens, gentamicina ar trebui să fie inclusă în kit pentru testarea fără probleme. În același timp, tulpinile rezistente la alte aminoglicozide cu sensibilitate la gentamicină pot fi găsite rar.

vancomicină

Vancomicina este unul dintre medicamentele de alegere (împreună cu oxazolidinonele) pentru tratamentul infecțiilor cauzate de tulpinile rezistente la oxacilină. Apariția rapoartelor privind stabilitatea stafilococilor la glicopeptide necesită o atenție deosebită evaluării rezultatelor studiului.

Medicamente suplimentare

Oxazolidinonele reprezintă o realizare importantă în tratamentul infecțiilor provocate de tulpinile rezistente la oxacilină, inclusiv cele rezistente la glicopeptide. În același timp, este necesar să se țină seama de faptul că se cunoaște deja formarea rezistenței la antibiotice a acestui grup.

Alte droguri

• Cotrimoxazol.
• Cloramfenicol.
• Acid fusidic.
• Tetracicline.
• Rifampicină.

Semnificația acestor medicamente în tratamentul infecțiilor stafilococice cauzate de tulpinile sensibile la meticilină este mică, deoarece este inferioară activității beta-lactamelor. Eficacitatea lor clinică în infecțiile cauzate de tulpinile rezistente la oxacilină nu a fost studiată în mod adecvat.

Rifampicina, co-trimoxazolul și acidul fusidic nu pot fi recomandate ca monoterapie din cauza frecvenței ridicate a selecției de rezistență în timpul tratamentului.

Genera un set specific de antibiotice pentru a evalua sensibilitatea la antibiotice a stafilococilor cel mai adecvat, pe baza distribuției de frecvență a datelor în meticilina de spital. În absența sau metitsillinrezistentnye de joasă frecvență este suficientă pentru a limita evaluarea sensibilității la oxacilină (în termeni de supraveghere), macrolidele sau poate chiar un 1 - 2 medicamente utilizate de fapt, într-un spital special pentru tratamentul infecțiilor stafilococice. În cazul unei incidențe ridicate a rezistenței la meticilină, ar trebui inclusă în studiu o gamă largă de antibiotice.

Informații generale și comerciale