Practic importante tehnologii in vitro sunt dezvoltate folosind obiecte de complexitate diferite ale organizației, de la protoplaste izolate la organe sau embrioni izolați. Cu toate acestea, celulele cultivate joacă un rol central. Principalul tip de celulă de plantă cultivată este calusul.
Țesutul de țesut. sau calusul este un țesut care a apărut prin proliferarea neorganizată a celulelor de plante. La rândul său, proliferarea este creșterea celulelor și țesuturilor prin reproducere.
Pentru fragmente de țesut calus de diferite organe ale plantelor, numite explantele au fost plasate într-un mediu de cultură artificial în eprubete, flacoane sau vase Petri. Procesul de obținere și cultivare a calusului necesită asepsie absolută. Explantele au fost tratate cu diferite soluții de sterilizare care conțin clor activ sau mai mercur (hipocloriți, clorură mercurică, diacid), la care se adaugă pentru o mai bună umectare detergenți. Suplimentele nutritive și mâncărurile înainte de utilizare sunt sterilizate cu abur fierbinte în autoclave. Compușii care se descompun la temperaturi ridicate sunt sterilizați prin filtrare prin filtre speciale a căror dimensiune a porilor nu depășește 0,2 pm.
Compozitia mediile nutritive sub formă de săruri sunt elemente de bază necesare pentru a menține viața plantelor: potasiu, calciu, azot, magneziu, fosfor, sulf și oligoelemente: fier, zinc, bor, cupru, mangan, cobalt și altele. Celulele cultivate nu sunt capabile de fotosinteză, prin urmare, în mediile de cultură, ca sursă de energie inclus zahăr, de obicei, zaharoză sau glucoză. Celulele calus, de asemenea, nevoie de vitamine. Necesitatea unui azot organic cunoscut prin administrarea mediului hidrolizat de cazeină sau aminoacizi individuali. O componentă foarte importantă a mediilor de cultură sunt fitohormoni naturale (IAA, IBA, zeatina) sau regulatori de creștere sintetice cu activitate hormonală: auxinelor - Acid naftilacetic (NAA), 2,4-diclorofenoxiacetic al acidului (2,4-D) sau cytokinin - benzilaminopurină (BAP ), kinetin și colab. au dezvoltat mai multe variante de medii de cultură standard de.
Țesutul format pe mediul nutritiv din celulele explante se numește calus primar. Pentru a-și menține creșterea, pe măsură ce celulele sunt epuizate, o parte din calus este transferată periodic într-un mediu nutritiv proaspăt. Timpul dintre transplanturi (subculturi) variază în funcție de rata de creștere a țesuturilor de la 3 la 6 săptămâni. Calusul, menținut în mod constant în cultură in vitro, se numește pasibil.
Cultivarea calusului pe un mediu nutritiv solid se numește superficial. În plus față de cultura de suprafață, este posibil să se obțină o cultură de suspensie a celulelor cultivate într-un mediu nutritiv lichid. Compoziția mediului lichid este, în general, aceeași ca cea a solidului, dar fără agar. Pentru producerea unei culturi de suspensie, cearceafele care se dizolvă într-un mediu lichid în celule individuale și sunt mai potrivite grupuri de 5-50 celule-agregate. Culturile de suspensie sunt cultivate în baloane cu agitare obligatorie pe agitatoare pentru a asigura aprovizionarea normală a celulelor cu oxigen. Periodic, o parte din suspensie este transferată într-un mediu nutritiv proaspăt pentru a menține creșterea continuă. Celulele într-un mediu nutritiv lichid se înmulțesc de obicei mai repede decât pe un solid, astfel încât timpul dintre transplanturi este redus la 2-3 săptămâni.
Starea țesuturilor cultivate este estimată prin proporția celulelor vii, rata de creștere și activitatea diviziunilor celulare. Viabilitatea celulară a fost determinată sub microscop cu utilizarea de coloranți speciali, de exemplu, albastru Evans sau albastru de metilen, fenosafranina, eozina și altele. Vopseaua nu pătrunde în celulele vii, a păstrat integritatea membranei plasmatice, deci numai pata celulele moarte.
Creșterea culturilor este evaluată prin creșterea greutății umede sau uscate a țesutului în ciclul de creștere sau prin creșterea numărului de celule în 1 ml. Ultimul indicator este folosit mai des pentru culturile de suspensie. Creșterea țesuturilor constă în împărțirea și întinderea celulelor. Pentru a măsura activitatea fisiunii, utilizați o măsură numită indicele mitotic. Aceasta este proporția celulelor care sunt în prezent în faza de mitoză. Se determină indicele mitotic sub microscop pe preparate de strivit sau secțiuni de țesut pătat atsetoorseinom acetocarmine sau ca procent din numărul total de diviziune a celulelor.
Creșterea culturii de țesut in vitro descrisă curba în formă de S. Întregul ciclu de creștere poate fi împărțită în mai multe faze: latentă (fază lag), în cazul în care o creștere vizibilă nu este respectata; exponențială, unde creșterea este accelerată; liniar, în cazul în care rata de creștere este constantă; faza de decelerare a creșterii, faza staționară, în timpul căreia masa de țesut și numărul de celule nu se schimbă și degradarea fazei însoțită de moartea celulelor. În funcție de speciile de plante utilizate explant, compoziția condițiilor mediu de cultură sau de creștere raportul dintre durata fazelor individuale ale ciclului de creștere poate varia.
Celulele plantelor cultivate in vitro, au o abilitate unica de a partaja nu numai pentru a forma o masă neorganizată de creștere, dar, de asemenea, trece la diferențierea secundară, dând naștere la elementele sistemului vascular, organe sau germeni zarodyshepodobnym structuri care se dezvoltă ulterior într-o plantă întreagă. Proprietatea celulelor izolate pentru a-și realiza pe deplin potențialul lor de dezvoltare prin formarea unui nou organism se numește totipotenție. Totalitatea proceselor de diferențiere a celulelor cu formarea de organe și țesuturi specializate este unificată de conceptul de morfogeneză în cultură in vitro.
Factorul principal care determină tranziția unei celule multiplicate neorganizate la morfogeneză este o modificare a setului sau a cantității de factori hormonali în mediul nutritiv. Împreună cu hormoni, inducerea morfogenezei este influențată de zaharuri, aminoacizi individuali și alte substanțe trofice. De asemenea, sunt importante intensitatea și calitatea iluminatului, a temperaturii, aerarea și alți factori fizici.
Există mai multe tipuri de morfogenezei: histogeneză, organogeneza si embriogeneza somatică. Histogeneză. sau diferențierea histologică a celulelor călușului este formarea de calus în țesuturi diferite: elementele sistemului vascular, mlechnikov, fibre, tricomi. Organogeneză - o diferențiere a celulelor călușului în organe întregi. În funcție de tipul corpurilor formate disting gynogenesis - formarea de apexurilor stem, formarea rădăcină - semn de carte Începuturile rădăcini și ale morfogenezei florale - formarea de Tsvetkova meristem. embriogeneza somatica - este formarea de calus în cultură în suspensie sau embryoid - structuri zarodyshepodobnyh capabile de a dezvolta într-o instalație pentru adulți.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: