Crearea vectorilor suficient de convenabili și, eventual, universali, pentru administrarea genetică a celulelor țesutului și a corpului
Ingineria genetică ca metodă de biotehnologie
Ingineria genetică este o metodă de biotehnologie care se ocupă
studii privind restructurarea genotipurilor. Genotipul nu este doar o sumă mecanică a genelor, ci una complexă care a evoluat în procesul de evoluție
organisme. Ingineria genetică vă permite să transferați informații genetice de la un organism la altul prin operații in vitro. Transferul genelor face posibilă depășirea barierelor interspecifice și transferarea trasaturilor ereditare individuale ale unui organism în altul.
Purtătorii de baze materiale ale genelor sunt cromozomi, care includ ADN și proteine. Dar genele educației nu sunt chimice, ci funcționale. Din punct de vedere funcțional, ADN-ul constă din multe blocuri care stochează o anumită cantitate de informații - genele. Baza acțiunii genei este capacitatea acesteia prin ARN de a determina sinteza proteinelor. Molecule de ADN, deoarece au fost înregistrate informații care determină structura chimică a moleculelor de proteine. O genă este o regiune a unei molecule de ADN care conține informații despre structura primară a unei singure proteine (o genă, o proteină). Din moment ce zeci de mii de proteine sunt prezente în organisme, există zeci de mii de gene. Totalitatea tuturor genelor celulei este genomul său. Toate celulele din organism conțin același set de gene, dar în fiecare dintre ele se realizează o parte diferită a informațiilor stocate. Prin urmare, de exemplu, celulele nervoase diferă, de asemenea, în funcție de caracteristicile funcționale structurale și biologice din celulele hepatice.
Restructurarea genotipurilor, atunci când se efectuează sarcini de inginerie genetică,
este o schimbare calitativă a genelor care nu au legătură cu modificările structurii cromozomilor vizibile în microscop. Modificările genelor se datorează în primul rând transformării structurii chimice a ADN-ului. Informații despre structura proteinei, înregistrate ca o secvență de nucleotide, sunt realizate ca o secvență de aminoacizi în molecula de proteină sintetizată. Modificări în secvența de nucleotide în ADN-ul cromozomial și pierderea unor alte modificări compoziție includere nucleotidică rezultată moleculă de ADN ARN, iar aceasta, la rândul ei, determină o nouă secvență de aminoacizi în sinteză. Ca rezultat, o nouă proteină începe să fie sintetizată în celulă, ceea ce duce la apariția de noi proprietăți în organism. Esența metodelor de inginerie genetică este aceea că genele sau grupurile de gene individuale sunt integrate sau exclud din genotipul organismului. Ca urmare a încorporării genei absente anterior în genotip, este posibil să se facă celulele care sintetizează proteine pe care nu le-au sintetizat anterior [1].
Cea mai obișnuită metodă de inginerie genetică este metoda
obținerea de recombinare, adică conținând o genă străină, plasmide. Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenar constând din câteva mii de perechi de nucleotide. Acest proces constă în mai multe etape.
1. Restricție - tăierea ADN, de exemplu, o persoană în fragmente.
2. Ligație - un fragment cu gena dorită este inclus în plasmide și cusut împreună.
3. Transformarea-introducerea de plasmide recombinante în celulele bacteriene.
Bacteriile transformate dobândesc astfel anumite proprietăți. Fiecare dintre bacteriile transformate se înmulțește și formează o colonie a multor mii de descendenți - o clonă.
4. Screening-selecție printre clonele bacteriilor transformate care sunt plasmide care poartă gena umană dorită.
Întregul proces se numește clonare. Prin clonare
Puteți obține mai mult de un milion de copii ale oricărei bucăți de ADN uman sau
un alt organism. Dacă fragmentul clonat codifică o proteină, atunci
experimental este posibil să se studieze mecanismul care reglează transcripția acestei gene și, de asemenea, să se genereze această proteină în cantitatea potrivită. În plus,
Fragmentul ADN clonat al unui organism poate fi introdus în celulele unui alt organism. Aceasta poate realiza, de exemplu, randamente ridicate și durabile datorate genei introduse, oferind rezistență la o serie de boli. Dacă introduceți în genotipul de bacterii din sol, genele altor bacterii care au capacitatea de a fixa azotul atmosferic, bacteriile din sol se poate traduce aceasta azot din azotul legat de sol. Introducerea genei din bacteria E. coli din genotipul uman, controlând sinteza insulinei, oamenii de stiinta au realizat productia de insulina prin intermediul unui astfel de E. coli. Odată cu dezvoltarea ulterioară a științei, devine posibil să se introducă gene care lipsesc în embrionul uman și, astfel, să se evite bolile genetice. [2]
Experimentele privind clonarea animalelor au avut loc de mult timp. Suficient pentru a elimina din nucleu implantul de ou în alt nucleu ei de celule prelevate din țesutul fetal, și să crească ea - fie in vitro sau in uter
mama adoptivă. Cotul de miel clonat a fost creat în mod neconvențional. Miezul din cușca de umbre a unei oi adulte de o vârstă de 6 ani dintr-o rasă a fost transplantat într-un ou nenuclear al unei oi de altă rasă. Embrionul în curs de dezvoltare a fost plasat în oile celei de-a treia rase. Deoarece oaia născută a primit toate genele primului donator de ovine, este copia sa genetică exactă. Acest experiment deschide o mulțime de noi oportunități pentru clonarea raselor de elită, în loc de mulți ani de reproducere.
Oamenii de știință de la Universitatea din Texas au reușit să extindă viața mai multor tipuri de celule umane. De obicei, celula moare după ce a supraviețuit aproximativ 7-10 procese de fisiune și au obținut o sută de diviziuni celulare. Imbatranirea, potrivit oamenilor de știință, se datorează faptului că celulele pierd telomeri, structuri moleculare care se află la capetele tuturor cromozomilor din fiecare divizie. Oamenii de știință au implantat celulele în care au descoperit gena responsabilă de producerea telomerazei și astfel i-au făcut nemuritori. Poate că aceasta este calea viitoare către nemurire.
Din anii 80, au existat programe de studiere a genomului uman. În
2. Metode utilizate în ingineria genetică
Metodele de inginerie genetică sunt utilizate într-o anumită secvență și mai multe etape se disting în efectuarea unui experiment tipic de inginerie genetică care vizează clonarea unei gene, și anume:
1. Izolarea ADN-ului din celulele organismului de interes (inițial) și izolarea vectorului ADN.
2. Taierea (restricționarea) ADN-ului organismului sursă la fragmente conținând genele de interes, utilizând una din enzimele de restricție și izolarea acestor gene din amestecul de restricție format. În același timp, ADN vector este tăiat (restricționat), transformându-l dintr-o structură inelară într-o structură liniară.
3. Închiderea segmentului ADN de interes (gena) cu ADN-ul vectorului pentru a obține molecule de ADN hibrid.
4. Introducerea moleculelor de ADN hibrid prin transformarea în alt organism, de exemplu, în E. coli sau în celulele somatice.
5. Semănarea bacteriilor în care au fost introduse molecule de ADN hibrid, la mediile nutritive care permit creșterea numai a celulelor care conțin molecule de ADN hibrid.
6. Identificarea coloniilor constând din bacterii care conțin molecule de ADN hibrid.
7. Izolarea ADN-ului clonat (genele clonate) și caracteristicile acestuia, inclusiv secvențierea bazelor azotate într-un fragment de ADN clonat.
ADN-ul (sursa și vectorul), enzimele, celulele în care ADN-ul este clonat sunt toate numite "unelte" ale ingineriei genetice.
3. Vectori genetici
Prin termenul "vector" se înțelege o moleculă de acid nucleic capabilă de existență autonomă după introducerea în celulă datorită prezenței semnalelor de replicare și transcripție în ea.
Vector moleculele ar trebui să aibă următoarele proprietăți:
1) abilitatea de a replica autonom în clicul destinatarului, adică un replicon independent;
2) conțin una sau mai multe gene marker, datorită expresiei a căror semne noi apar în celula receptor, ceea ce face posibilă distingerea celulelor transformate de cele originale;
3) conțin unul sau cel mult două situri pentru diferite enzime de restricție în diferite regiuni (inclusiv gene marker), dar nu în zona responsabilă pentru replicarea lor.
În funcție de scopurile experimentului, vectorii pot fi împărțiți în mod condiționat în două grupe: 1) utilizate pentru clonarea și amplificarea genei dorite; 2) specializat, utilizat pentru exprimarea genelor străine încorporate. Al doilea grup de vectori combină vectori pentru a asigura sinteza proteinelor produse de gene clonate. Vectorii pentru exprimare conțin secvențe ADN care sunt necesare pentru transcrierea copiilor clonate ale genelor și translația mRNA lor în tulpini de celule. [4]
Ca vectori procarioti, sunt utilizați plasmidele, bacteriofagii; ca vectori eucariotici utilizează virusuri animale și vectori pe bază de plante și drojdie 2 mitocondrii microni și numărul de vectori construiți în mod artificial, capabile de replicare în bacteriene sau în celule eucariote (vectori de transfer).
Plasmidele sunt elemente genetice extrachromozomale ale pro- și eucariotelor care replică în mod autonom în celule. Majoritatea vectorilor plasmidici sunt derivați din plasmidele naturale ColE1, pMB1 și p15A.
Plasmidele bacteriene sunt împărțite în două clase. Unele plasmide (de exemplu, un factor bine studiat F care determină sexul E. coli) sunt capabile să treacă de la celulă la celulă, altele nu posedă această capacitate. Din mai multe motive și mai ales pentru a preveni răspândirea necontrolată a materialului genetic potențial periculos, marea majoritate a vectorilor plasmidici bacterieni se bazează pe plasmidele din clasa a doua. Multe plasmide naturale conțin deja gene care determină rezistența celulelor la antibiotice (produsele acestor gene sunt enzime care modifică sau scindează substanțele antibiotice). În plus, în timpul construirii vectorilor, în aceste plasmide se introduc gene suplimentare, care determină rezistența la alte antibiotice. [5]
În Fig. 1 prezintă una dintre cele mai comune vectori plasmide E.coli - pBR322. Acesta este proiectat pe baza detaliilor studiate plasmid E.coli - factor kolitsinogennogo ColE1 - și conține o origine de replicare a plasmidei. Caracteristică ColE1 plasmid (și pBR322, respectiv), este că, în prezența cloramfenicol antibiotic inhibitor al sintezei proteinelor (inhibarea indirect replicarea cromozomului gazdă) numărul său în E. coli crește oscilează de la 20-50 la 1000 molecule per celulă care produce cantități mari de clonat gena. La proiectarea plasmidele vectorul pBR322 de original a fost delegat la un număr de „extra“ site-uri pentru enzime de restricție.
Figura 1. Hartă de restricție detaliată a plasmidei pBR322.
În prezent, împreună cu o serie de sisteme vector convenabil pentru vectori plasmidici E. coli proiectat pentru o serie de alte bacterii Gram-negative (inclusiv un astfel comercial important ca Pseudomonas, Rhizobium și Azotobacter), bacterii Gram-pozitive (Bacillus), ciupercile inferioare (drojdie) și plante .
Vectorii plasmidi sunt convenabili pentru clonarea fragmentelor relativ mici (până la 10.000 de perechi de baze) de genomuri mici. Dacă este necesară obținerea unei biblioteci de clone (sau a unei biblioteci) de gene de plante și animale superioare, a căror lungime totală a genomului atinge dimensiuni enorme, atunci vectorii uzuali ai plasmidelor în aceste scopuri sunt inadecvați. Problema creării de biblioteci de gene pentru eucariotele superioare a fost rezolvată utilizând derivații bacteriofagi ca vectori de clonare.
Printre vectorii fagi sistemele cele mai convenabile au fost stabilite pe baza genomul bacteriofagului M13 și l E.coli. ADN-ul acestor fagi conține zone extinse care pot fi delegate sau înlocuite cu ADN-ul străin, fără a afecta capacitatea lor de a se replica în celulele E. coli. La construirea unei familii de vectori pe bază de ADN l fagi din acestea primele (diviziuni pe regiuni scurte de ADN) au fost eliminate mai multe situsuri de restricție din regiune nu este esențială pentru replicarea ADN-ului, și a lăsat acele situri în zona destinată pentru inserția ADN-ului străin. În aceeași zonă este adesea introdus gene marker care distinge ADN recombinant din vectorul original. Astfel de vectori sunt utilizate pe scară largă pentru a produce o „bibliotecă de gene“. Mărimea ADN-ul fragmentului de înlocuire și fagi, respectiv, inglobate porțiune ADN străin mărginită 15-17000. Resturile nucleotidice au fost fago gena recombinantă, care este de 10%, mai mult sau 75% mai mică decât genomul fagic sălbatic-l, nu pot fi ambalate în particule de fagi. [6]
Astfel de limitări teoretic nu există pentru vectorii construiți pe baza bacteriofagei filamentoase M13. Au fost descrise cazuri în care un ADN străin cu o lungime de aproximativ 40.000 de resturi de nucleotide a fost inserat în genomul acestui fag. Se știe, totuși, că fagul M13 devine instabil când lungimea ADN străin depășește 5.000 de resturi de nucleotide. De fapt, vectorii derivați din ADN-ul fagului M13 sunt utilizați în principal pentru secvențierea și mutageneza genelor, iar dimensiunile fragmentelor încorporate sunt mult mai mici.
Acești vectori sunt construite din replekativnoy formă ADN (dublu catenar) a fagului M13, care sunt „poliliant“ porțiuni integrate (un exemplu de astfel de structură este prezentată în Fig. 2). În particula de fagă, ADN-ul este inclus ca moleculă mono-catenară. Astfel, acest vector face posibilă obținerea unei gene clonate sau a unui fragment al acesteia atât în formă de două catenări, cât și dintr-o singură catenară. Formele monocatenare ale ADN-ului recombinant sunt utilizate pe scară largă în prezent atunci când se determină secvența de nucleotide a ADN-ului prin metoda Sanger și pentru mutageneza genei dirijată pe oligodeoxinucleotide.
Transferul de gene străine în celulele animale, prin utilizarea de vectori derivați din ADN-ul dintr-un număr de virusuri bine caracterizat de animale - SV40, unele adenovirusuri, virusul papiloma bovin, virusul variolei, și așa mai departe. Construirea acestor vectori se realizează prin procedura standard: eliminarea „extra“ site-uri pentru endonucleazele de restricție, introducerea genelor marker în regiunea ADN nu este esențială pentru replicarea acestuia (de exemplu, gena timidin kinaza (tk) a HSV (virusul herpes simplex)), introducerea regiunilor de reglementare, crește nivelul de exprimare a genei.
Au fost convenabile așa-numitele "vectori de transfer", capabili să se reproducă atât în celulele animale cât și în celulele bacteriene. Acestea sunt obținute prin coaserea segmente împreună mari de animale și vectori bacterieni (de exemplu, SV40 și pBR322), astfel încât regiunile responsabile pentru replicarea ADN-ului au rămas intacte. Acest lucru permite operațiunilor de bază să construiască un vector într-o celulă bacteriană (care este mult mai simplu din punct de vedere tehnic) și apoi să folosească ADN-ul recombinant rezultat pentru a clona gene într-o celulă animală. [7]
Figura 2. Harta de restricție a vectorului M13 mp8.
4. Crearea vectorilor universali suficient de convenabili și pe cât posibil universali pentru administrarea genetică a celulelor țesutului și a corpului
Un punct important în proiectarea vaccinurilor ADN este problema introducerii genetice la celulele necesare și protejarea ADN-ului introdus de acțiunea nucleazelor din sânge. Ca urmare a muncii experimentale, s-au creat diferite modele care permit transmiterea genelor țintă către celulele țintă.
Unul dintre aceste modele este modelul vectorului molecular pentru a furniza gene in celule, cum ar fi limfocite și keratinocite. Modelul a fost utilizat ca o genă care codifică o proteină de fuziune: necroză tumorală alfa-factor - interferon-gamma. In centrul vectorului este un plasmid ADN intact conținând gena livrate, și aranjate pe suprafața anticorpului la celulele țintă. Poliglyukina cu conjugat spermidina și anticorp este folosit pentru a lega componentele (spermidina încărcată pozitiv asigură legarea de conjugat plasmide ADN). Sunt descrise în mod specific permite vectorului molecular pentru a furniza gene in celule tinta, minimizând astfel pătrunderea acestora în alte tipuri de celule, gene sunt livrate pentru a proteja de nucleaze și de a folosi sângele încărcat pozitiv polyglukin spermidina complex ca ADN-ul promotor de penetrare in celule.
În prezent, a fost creat un model vector pentru livrarea la celulele măduvei osoase a unei gene care codifică factorul de stimulare a coloniilor umane de granulocite (hG-CSF). Această proteină aparține familiei de factori de creștere hematopoietici și este unul dintre regulatoarele fiziologice, stimulează în mod specific și extrem de eficient proliferarea și diferențierea neutrofilelor hematopoietice progenitoare. hG-CSF mărește durata de viață a celulelor din măduva osoasă, îmbunătățește activitatea funcțională a neutrofilelor mature. Vectorul creat este o construcție cu mai multe straturi. "Miezul central" al constructului este plasmida pGGF8 care conține gena hG-CSF. Este înconjurată de o cochilie de polizaharidă, care constă din poliglucin și spermidină. Stratul proteic exterior conține un amestec de albumină serică și transferin-proteină de transfer. Eficacitatea modelului de vector descris a fost dovedită de experiență.
1. Gren E. Ya. Pumpen PP Capside virale recombinante - o nouă generație de proteine și vaccinuri imunogene // Jurnalul VHO. - 1988. - Vol. II, №5. - cu. 531-536.
2. Dmitriev BA Probleme și perspective de creare a vaccinurilor sintetice / / Imunologie. - 1986. - №1. - cu. 24-29.
4. Mertvetsov NP Beklemishev AB Savich IM Abordări moderne pentru proiectarea vaccinurilor moleculare. - Novosibirsk: Science, 1987, 210 p.
7. Shchelkunov SN Clonarea genelor. - Novosibirsk: Science, 1986, 232 p.
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: