• Proteinele motoare își păstrează activitatea în extractele celulare. Aceasta vă permite să le selectați într-o formă purificată
• Proteinele motoare se atașează la sticlă și permit microtubulilor să alunece pe suprafață
• Bilele - bile acoperite cu proteine motorii, pot fi transportate prin microtubuli
• Folosind microtubuli cu polaritatea indicată, puteți stabili în ce direcție motorul se deplasează de-a lungul acestuia
Descoperirea și izolarea proteinelor cu motor microtubule au fost asociate cu dezvoltarea unor noi tehnici care permit cercetătorilor să studieze mobilitatea lor în extractele de celule in vitro sau folosind preparatele purificate ale motoarelor proteice. Prin deschiderea kinesin a condus observarea vezicule se deplasează în celulele extract brut - citoplasmei în esență nediluat - fierte dintr-un singur axon gigant de calmar.
Axon este un obiect promițător pentru căutarea unor astfel de motoare moleculare, deoarece microtubulele sale poartă o mișcare intensă a veziculelor. Axon gigant de calmar a fost separat de corp și din citoplasmă extrudat (sau axoplasm deoarece preferă să cheme neurologi), care este de a monitoriza mișcarea a fost plasată pe o lamă de sticlă. Prin fracționarea axopei și investigarea mobilității fiecărei fracții Ron Vale și colab. a identificat primul motor Kinesin.
Spre deosebire de studiile biochimice tradiționale. care sunt efectuate în eprubete, mobilitatea este examinată sub microscop, ceea ce vă permite să urmăriți mișcarea furnizată de motor. Cum poate fi observată activitatea motorului sub microscop? Pentru a detecta mișcarea, trebuie să monitorizați obiectul la timp. În acest caz, proteinele trebuie să fie native. Prin utilizarea microscopiei electronice, acest lucru este exclus.
Aceasta din urmă necesită un tratament chimic rigid al probelor, care inactivează proteinele. Microscopia de lumină nu are o rezoluție atât de înaltă ca cea electronică, dar are avantajul că aceasta necesită, de regulă, o prelucrare a eșantionului mai puțin rigidă sau nu necesită deloc. Prin urmare, poate fi folosit pentru a studia procesele care necesită proteine active și care durează câteva minute sau mai mult. Cu toate acestea, microtubulii sunt prea mici pentru ca mobilitatea asociată cu acestea să fie observată cu ajutorul unui microscop de lumină convențional.
Imaginea microtubulei obținută prin microscopie DIC urmată de amplificarea computerelor.
Imaginea pare granulară, dar poziția microtubulului și lungimea sa sunt clar vizibile.
Folosind această metodă, puteți măsura lungimea microtubulilor, puteți observa mobilitatea și procesele de transport cu participarea lor.
Este interesant faptul că pentru studiul mobilității motoarelor proteice nu este necesară încărcarea. Acest lucru se datorează faptului că, spre deosebire de microtubuli, motoarele proteice se leagă de suprafețele de sticlă (obiectivul microscopic și geamul de acoperire). Atunci când se leagă doar la motoare, activitatea lor permite microtubulilor să se deplaseze de-a lungul suprafeței. Exemplele corespunzătoare sunt prezentate în figurile de mai jos.
Testul de deplasare a microtubulilor a fost utilizat pentru a studia fracțiile biochimice care au fost obținute în timpul purificării primului kinesin. Acest test este utilizat de obicei pentru a studia proteinele motoare ale microtubulilor. Într-una dintre modificările sale, sticle sau bile latex acoperite cu motoare proteice sunt utilizate, și se observă mișcarea lor de-a lungul microtubuli.
O astfel de "analiză a coloanei" este oarecum mai complicată, deoarece este necesar să se observe perle și microtubuli cu ajutorul unui microscop luminos. În toate cazurile, microtubulii sunt inițial stabilizați prin legarea lor la paclitaxel.
O caracteristică caracteristică a motoarelor proteice este că acestea sunt capabile să se deplaseze de-a lungul microtubulei într-o singură direcție. Pentru a determina dacă motorul se mișcă spre capătul plus sau minus, este necesar să se știe cum se determină polaritatea microtubulei. O modalitate de a determina polaritatea implică mai întâi asamblarea structurilor microtubulilor radiali pe centrosomi izolați și apoi fixarea lor pe diapozitiv. Apoi, se pune sticla pe acest pahar și se urmărește mișcarea lor.
În acest caz, margelele. acoperite cu un motor proteic care se deplasează spre centrul structurii, se mută la minus-end, iar cele care se mișcă din centru se deplasează spre capătul de plus. O altă modalitate de a marca polaritatea microtubulilor se bazează pe o polimerizare mai rapidă a capătului plus. Pentru a efectua testul, se formează mai întâi microtubuli scurți cu un procent foarte mare de subunități conținând o sondă fluorescentă. Aceste microtubuli strălucitori sunt apoi utilizați ca locații de nucleare pentru o perioadă mai lungă de micrithrubochek într-o soluție care conține un procent mult mai mic de tubulină fluorescentă.
Moleculele de tubulină sunt adăugate la ambele capete ale tubulilor de nucleare, dar mult mai rapid la capătul de plus. Rezultatul este un set de microtubuli cu un plasture scurt și foarte luminos în mijloc și mai multe zone vizibile, dar vizibile la capete. Secțiunea de la capătul plus al horoso este mai lungă decât de la capătul minus, ceea ce face imediat posibilă determinarea polarității microtubulului. Aceste microtubuli fluorescenți cu polaritatea indicată pot fi utilizați pentru a determina mobilitatea pentru a determina direcția mișcării. Atunci când se descifrează rezultatele experimentului, este important să rețineți că motoarele proteice sunt fixe.
Când motorul se mișcă în direcția plus-capăt, microtubulul se va deplasa cu capătul minus. Aproape toate metodele de determinare a mobilității sunt variante ale acestor teste. Natura sarcinilor, detaliile dispozitivelor experimentale și rezoluția sistemului de detectare pot diferi, dar principiul de bază rămâne același.
Trimiteți-le prietenilor: