ECHIPAMENTE ȘI INSTRUMENTE
PREGĂTIREA CONTORATORILOR DONORI ȘI A RECIPIENȚILOR PENTRU TRANSFERUL EMBRYOON
Pentru a identifica semnele de estrus, se efectuează o probă regulată de iepe (și donatori și destinatari) cu o sondă de armasar. Este mai bine să efectuați testul zilnic. În prezența unui deficit de personal și a unei experiențe mari de experți, este permisă o probă mai rară, dar cel puțin de trei ori pe săptămână (de exemplu, luni, miercuri, vineri). Când detectezi o vânătoare, efectuează o verificare zilnică de două ori a stării ovarului prin metoda rectală.
Concomitent cu inseminarea găinilor donatoare, se efectuează lucrări de sincronizare a funcțiilor sexuale ale iepurelor-destinatari planificate cu ciclurile sexuale ale donatorilor de iepuri. Aplicabilitatea grefei are loc și cu o asincronizare mică a timpului de ovulație în marele donator și în marele primitor în transplantul anterior al ciclului sexual. Transplantul este permis dacă:
1) ovulația în recipientul de mare a apărut mai devreme decât la donator în decurs de 24 de ore (cum ar fi asincronizarea ciclurilor sexuale ale donatorului și ale recipientului este de +24 ore);
2) ovulația în recipientul mare a apărut mai târziu decât la donator în decurs de 72 de ore (-72 ore).
Transplantarea embrionilor cu o asincronie mai mare a timpului de ovulație al donatorului și al recipientului este nedorită și duce la o grefare redusă a grefelor.
În cazul în care donator și inseminate gradul în timp util și corectă sincronicității funcțiilor sexuale donator și destinatarul este în intervalul de la -72 până la + 24 de ore pentru a prepara o problemă de iepe transplanturi este finalizat, și este posibil să se aștepte un rezultat pozitiv. Extracția și transplantul de embrioni se efectuează la 8-8,5 zile după ovulație în celula donatoare.
PREGĂTIREA TABELELOR DE LABORATOR, A ECHIPAMENTELOR ȘI A PREMISELOR PENTRU TRANSPLANTAREA EMBRIONELOR
Lucrările de extracție și transplant de embrioni necesită respectarea strictă a normelor aseptice și sanitar-veterinare. Se recomandă utilizarea uneltelor și a uneltelor de unică folosință.
Sticlăriei, multe catetere sunt de unică folosință se spală cu un detergent neutru, apoi se clătește cu apă distilată și rulează bidistilată. Sticlăria (flacoane, pâlnii, pipete, plăcile) sunt uscate, învelite în hârtie pergament și sterilizate cu căldură uscată timp de 2 ore la o temperatură de 150 ° C sau 3 ore - la o temperatură de 140 ° C,
În același mod, un cateter metalic plasat într-un tub de sticlă pentru transplantarea embrionilor, pipeta pentru transferul de embrioni este dezinfectată. Un cateter din cauciuc pentru îndepărtarea embrionilor, seringilor și acelor este fiert în sterilizatoare separate timp de 40 de minute, apa este drenată fără deschiderea capacului și răcită la temperatura camerei.
În prezența unei autoclave, toate echipamentele termoizolante, salopeta, etc. pot fi sterilizate cu abur fierbinte la 1,5 atm. timp de 30 de minute.
Produsele realizate din material plastic, care nu poate rezista la sterilizarea la căldură, spălate, dezinfectate cu 70% etanol, se usucă, menținut sub iradiere UV timp de cel puțin 2 ore și ambalate într-o hârtie sterilă și depozitate într-o cameră de germicide. Înainte de a folosi instrumentele din cameră, iradierea este pornită din nou timp de 2-3 ore.
Mănușile din polietilenă și capacele de unică folosință sunt tratate cu lămpi bactericide într-o biocameră timp de 2 ore.
Cu o zi înainte de transplant se efectuează de curățare umedă planificată și dezinfecția spațiilor soluție 3% de peroxid de hidrogen (sau „Glyuteksa“). Pentru a prepara o soluție de dezinfectant la 9 litri de apă, se adaugă 1 litru de soluție de peroxid de 25-20% și 50 g de detergent. Pentru a dezinfecta aerul din cameră, utilizați lămpi bactericide, care includ timp de 2-3 ore și opriți cu o oră înainte de începerea lucrului la transplant. Cu o putere insuficientă de iradiere cu radiații ultraviolete (2 W / m2), durata sa este proporțional crescută. În încăperile unde se lucrează cu embrioni, trebuie menținută o temperatură de 25-28 ° C și o umiditate a aerului de 70-80%.
Dispozitivele și mesele de laborator sunt șterse cu tampoane de bumbac înmuiate în alcool de 70 °. Sticlele cu mediu tampon fosfat de Dulbecco sunt de asemenea tratate cu tampoane cu alcool, dopul și gâtul sunt arse cu flacăra arzătorului. Salopetele operatorilor sunt sterilizate într-un dulap de uscare sau autoclav în modul standard.
2. Soluția de clătire este folosită pentru spălarea donatorului uterin mare după extragerea embrionului în scopul de a suprima dezvoltarea sa completat în mod aleatoriu în microflora cavitate. Se prepară 2 litri de soluție de clorură de sodiu 0,9% (NaCl) pe bază de apă distilată. Disubstituiți aduce la fierbere (fierbere prevenirea), se răcește la 36-37 ° C și apoi se adaugă 20 ml dintr-o soluție de 3% din „poligon“ preparat (marca „Mosagrogen“) rata de 300 mcg / ml.
3. Soluția de transplant este un mediu îmbogățit cu surse de energie care susțin embrionul într-o stare viabilă. Pentru aceasta, FBS de Dulbecco este utilizat cu 3-5% ser fetal de vițel inactivat sau cu albumină serică de 5% bovină și antibiotice (poligeni la o concentrație de 300 μg / ml). În această soluție, embrionii sunt plasați într-un transplant și transferați în uterul iepelor destinatarului. Se prepară soluția într-un flacon de penicilină pre-sterilizat și înfundat. Pentru a face acest lucru, 10 ml de soluție se prelevează dintr-un flacon de FBS de Dulbecco cu o seringă sterilă și se pompează într-un flacon cu penicilină.
În seringă sterilă se adaugă 0,3-0,5 ml de inactivat (pre-îmbătrânit timp de 30 minute la 56-58 ° C într-o baie de apă) folosind ser fetal de vițel. Apoi se adaugă 0,1 ml de poligen (se calculează valoarea în conformitate cu doza inițială a medicamentului). Ingredientele sunt amestecate ușor, împiedicând formarea de spumă. Într-un astfel de mediu, embrionul poate fi păstrat la o temperatură între spălare și transplantare la 37 ° C în decurs de 30 de minute.
Pentru a menține temperatura optimă, toate cele trei soluții preparate sunt plasate într-un termostat cu o temperatură de 37 ° C.
Recent, firmele străine furnizoare (Minitube, Germania sau IMV, Franța) oferă embrionii de gata-spălare și cal în pachete convenabile care pot fi atașate la un cateter de spălare. Există, de asemenea, mediu gata pentru stocarea pe termen scurt a embrionilor, ambalate în 10-20 ml.
EXTRACTIA EMBRIONELOR DIN UTERINA LAPTELUI DONOR
Embrionii, în scopul transplantului lor ulterior, sunt spălați din uterul iepelor donatoare după 8-8,5 zile după ovulație. Lucrările de extracție a embrionilor trebuie efectuate în următoarea ordine:
1. Marele donator este pus în mașină, fixat. Eliberează-i rectul din scaun. Se efectuează toaleta organelor genitale externe și adiacente acestora. Coada este bandajată sau plasată într-un capac special din polietilenă de unică folosință și legată de bara superioară a mașinii.
2. Făcătorul îndepărtează un cateter din sterilizator într-o mănușă din polietilenă de unică folosință, îmbrăcată într-o mănușă cu o singură dată iradiată cu UV. Asistentul prin pâlnie se clătește din interior cu lichidul de spălare pregătit. Făcătorul pune pe mâna, care comprimă capul cateterului, un capac de protecție din polietilenă. Partea finală a acoperișului îl ia într-o mână, închizând din afară cateterul și, ținând degetele, taie vârful capacului, oferind o gaură în el.
3. făptuitorul intră în brațul cu cateterul în iapa vagin separa degetele, mangaindu capacul și împingând capul sculei prin gaura din capacul canalului cervical, și apoi în corpul uterului, atâta timp cât cateter balon de latex nu trece pe deasupra colului uterin.
4. Pentru a stabiliza instrumentul în uter, seringa asistent printr-un canal de aer special pompe într-un cateter cu balon gonflabil 60 ml de aer, orificiu de blocare cervical din interior, și se închide trecerea aerului al clemei cateter. După aceea, cateterul trebuie tras ușor spre exterior, astfel încât balonul să se potrivească perfect cu cervixul.
5. Asistentul toarnă o cantitate mică de lichid de spălare prin pâlnie în cateter. Cateterul este apoi acoperit, împiedicând intrarea aerului în cateter. Asistentul îndepărtează pâlnia și coboară capătul exterior al instrumentului într-un balon de spălare. Infuzia ulterioară a soluției în uter și re-extracția acesteia se efectuează prin ridicarea și coborârea balonului de la 1 la 1,5 metri deasupra și sub nivelul genital al găinilor. Perfuzia uterului are loc pe principiul comunicării vaselor.
6. Efectuați o perfuzie de trei ori a uterului cu o soluție de spălare. Apoi clătiți uterul de două ori cu o soluție de clătire (vezi secțiunea "Pregătirea soluțiilor").
7. Aerisiți aerul din flaconul de fixare și scoateți cateterul din uter.
8. Flacoanele cu soluții utilizate sunt transferate într-o cameră specială sau într-o cameră bactericidă pentru căutarea și evaluarea embrionilor (oprind anterior radiația UV!).
9. Marele donator este eliberat și scos din mașina de fixare.
CĂUTAREA, ESTIMAREA ȘI COMPLETAREA EMBRONELOR ÎNTR-UN INSTRUMENT DE TRANSFER
embrionii viabili au o formă regulată translucid (sferic sau ușor elipsoidală), au o structură celulară distinctă și bine nucleaŃie mănunchi distinge (embryoblast). Membrana embrionară (capsula) se potrivește strâns cu masa celulară și nu este vizibilă la examinare (figura 7).
Embrionii morți sunt opaci, mat, carcasa exterioară (capsula) este sever separată de masa celulară, celulele sunt încrețite și comprimate într-o formă neuniformă (Fig.9). Transplantul de astfel de embrioni nu produce.
Figura 3. Cateter pentru extracția embrionilor
Figura 4. Cateter pentru transplantarea embrionilor mici (cu diametrul de până la 0,8 mm)
Figura 5. Cateter pentru transplantarea embrionilor mici în formă dezasamblată cu paie de 0,5 ml
Fig. 6. Pipetă pentru transplantarea embrionilor mari (mai mult de 0,8 mm în diametru) cu un cateter intern din plastic (2 buc.) Și un vârf pentru seringă
Fig. 7. Un embrion cal de 8 zile viabil
Fig.8 Embrion cal de șapte zile îndoielnic
Fig. 9. Embrionul pierdut de un cal de 8 zile
După evaluare, embrionul destinat transplantului este transferat printr-o pipetă sterilă dintr-o soluție de PBS într-un vas Petri cu o soluție de transplant. Pentru confortul muncii, luați un vas Petri cu diametru mic, soluția de transfer este turnată într-un strat subțire (2-3 mm) și așezată pe o masă de microscop cu o iluminare mai joasă. Prin seringa (1,2 ml), prin intermediul unui adaptor, un mediu cu embrionul, diametrul care nu depășește 07, 0,8 mm, 0,5 aspirat în paie de polietilenă (paie) în următoarea ordine: 1/3 -1/4 lungimea mediuului de transplantare, apoi 5-7 mm - bule de aer, apoi 1 / 3-1 / 4 pajeta - mediu cu embrionul, apoi din nou o bule de aer, iar spațiul rămas este umplut cu mediu. Când este în contact cu lichidul, dopul adeziv se solidifică, înfundând capătul lipitorului.
Coșul este deconectat de la adaptor și introdus în instrumentul de transplantare cu capătul deschis în afară, iar dopul cu clemă la știft, înșurubați capul instrumentului și introduceți un stilet pentru 2/3 din lungimea sa. Pe partea de sus a instrumentului, puneți-l pe un capac sanitar din polietilenă. Instrumentul gata pentru transplantare este stocat într-o poziție orizontală la o temperatură de cel puțin 18 ° C. O atenție deosebită este acordată pentru a se asigura că ștuțul inserat 2/3 din lungime nu este în mod accidental avansat mai adânc, ceea ce poate duce la pierderea embrionului.
Pentru un diametru de embrioni> 0,8 mm sunt furnizate cu pipeta interschimb un cateter plastic intern (de exemplu, compania tubular, Germania), în care embrionul este aspirat printr-o seringă cu un mediu de transfer într-un volum de 2 ml (Figura 6). În acest caz, nu este necesar să se umple embrionul în paie de 0,5 ml înainte de transplantare. Cateterul intern este fixat bine în pipetă. În acest caz, seringa rămâne conectată la cateter până la sfârșitul transplantului.
Atunci când lucrați cu embrioni, trebuie să monitorizați cu atenție temperatura soluțiilor și a mediului, schimbări bruște în care, atât într-o direcție cât și în cealaltă, pot duce la deteriorarea și moartea transplantului. Prin urmare, toate manipulările cu embrioni trebuie să fie efectuate într-o încăpere sau într-o cameră în conformitate cu regimul de temperatură cerut.
TRADUCEREA RECIPIENTULUI MEMBRU BABY
Transplantarea embrionului la recipientul mare se efectuează în următoarea secvență:
1. În primul rând, pentru a spori grefarea embrionului in iepelor uterului sunt sfătuiți să intre miorelaxant recipient (medicament „Hanegif“, Ungaria, intramuscular 8-10 ml), și, dacă este necesar, un sedativ.
2. După 15-20 de minute după injectare recipient mare a condus în mașină, repara, liber de fecale rect, se spală bine cu zona înconjurătoare săpun și organele genitale externe și, clătite și uscate cu prosoape de hârtie, bandaje și coadă fixă poziția superioară.
3. Îmbrăcat într-o mănușă de polietilenă sterilă de unică folosință, mâna este luată cu o unealtă transplantată cu un embrion și pe partea superioară a capului și se pune pe o manșon de protecție din polietilenă, așa cum este descris mai sus. Capacul exterior este lubrifiat cu un lubrifiant steril (gel-grăsime) pentru inseminare artificială sau cu ultrasunete. Pentru un cateter metalic cu paie, verificați cu atenție poziția deschiderii de ieșire a embrionului în raport cu fanta de pe mașina de spălat exterioară a cateterului pentru a orienta corect instrumentul în pântecul maretei (gaura în jos).
4. Introduceți o mână cu instrumentul în vaginul cărnii.
Deconectați capacul superior de protecție. Împingeți ușor capul instrumentului în canalul cervical. Fără a atinge stiletto, perforați instrumentul cu un al doilea capac de protecție sanitară. Pentru o pipetă cu un cateter intern, ar trebui să luați ajutorul unui asistent care trebuie să țină seringa atașată la cateter astfel încât să nu se rupă și lichidul cu embrionul să nu se toarne prematur.
5. Introduceți corpul sculei al uterului iepei recipient la o adâncime de 2-5 cm. Instrument al canalului Orientarea șaibă, astfel încât orificiul său de evacuare în uter a fost îndreptată în jos, a împins conținutul Piet, alunecarea stilet într-un instrument prin intermediul. Când se utilizează o pipetă cu un cateter interior, o seringă atașată stoarce conținutul său (2 ml de mediu cu embrionul) în uterul iapa.
6. Scoateți mâna de pe instrument din vagin. Eliberați și scoateți găleata din aparat. După transplantul recipientului de mare, se recomandă să conducăți 5-7 minute înainte de al pune în cutie.
Ulterior recipient mare terapie curs recomandat progestin (injecții intramusculare zilnice de 2,5 ml de 4% progesteron în ulei sau progesteron în formă orală (Regumeyt, altrenogestul) pentru a menține funcția corpus luteum pentru apariția și menținerea sarcinii. Tratamentul beneficiarului se efectuează, cel puțin înainte de placentare (45 de zile de trolling).
INSTRUCȚIUNI PRIVIND INSPECȚIA ARTIFICIALĂ ȘI TRANSPLANTAREA EMBRONELOR DE PORUMB. - Divovo: Ed. Institutul de Cercetări de Stat pentru Creșterea Celor
Articole similare
Trimiteți-le prietenilor: