Medicamentul pentru prevenirea și tratamentul difteriei și modul în care este produsă

Invenția se referă la medicină, în special la imunologie, și poate fi utilizată pentru imunoprofilaxie și imunoterapie difterică.

Metoda tradițională de tratare a difteriei este ser intramuscular difterică (PDS), obținut din sângele cailor cu toxoidul difteric imunizați care conțin imunoglobuline specifice care neutralizează toxinele bacteriene difteriei. În 1 ml de ser conține cel puțin 1500 de unități antitoxice internaționale de activitate (ME). Ca o modalitate eficientă de tratare a difteriei, PPP-ul are o serie de dezavantaje: introducerea unor cantități semnificative de proteine ​​străine oferă posibilitatea reacțiilor anafilactice și boala serului (LA Favorova etc. Difterie - M. Medicina, 1988. - P. 187-192 ..).







Cu toate acestea, această metodă nu permite să se obțină produse cu puritate ridicată: produsul final este un set de F (ab) 2 fragmente de imunoglobuline de specificități diferite, în care anticorpul (antitoxina) împotriva antigenului imunizat producătoare constituie nu mai mult de 25% din conținutul total de proteine . Ca rezultat, serurile antitoxice rămân supraîncărcate cu proteine ​​de balast și, în unele cazuri, pot provoca reacții anafilactice cu severitate variabilă din partea beneficiarului. În plus, medicamentele sunt contaminate cu substanțe din grupa sanguină (GVK), care pot provoca, de asemenea, complicații la introducerea serurilor.

Rezultatul tehnic al invenției constă în prepararea unui preparat antidifteric înalt purificat cu reactogenicitate redusă din materii prime eterogene. Medicamentul pentru prevenirea și tratamentul difteriei este o formă liofilizată.

Problema este rezolvată prin prepararea unui medicament pentru prevenirea și tratamentul difteriei fermentate ser de cal hiperimun folosind purificare de imunoafinitate.

Preparatul rezultat este monofracțional, în timp ce preparatul prototip are impurități pronunțate ale proteinei inactive (Figura 1). Medicamentul pentru prevenirea si tratamentul difteriei este monoretseptornym: dublu imunodifuzia ca răspuns la toxoidul difteric formează o linie de precipitare, în timp ce ser (prototip) - 2-3 linii (Fig 2.).

Caracteristicile preparatelor obținute prin metode cunoscute și propuse sunt prezentate în tabelul nr. 1-3.

Un grad ridicat de purificare si lipsa HVA furniza redus de droguri reactogenității pentru prevenirea și tratamentul difteriei, obținute din materiale eterogene (Tabelul 1, 2 ,.), în timp ce are proprietăți de protecție ridicate: o doză minimă de seruri antitoxina 0,03-0,125 UI / ml , care corespunde titrului protector pentru difterie, protejează 100% din animale de administrarea a 1,8-5,6 LD50 toxină difterică (Tabelul 3). Uscarea liofilică permite obținerea unor formulări de dozare uscate foarte active adecvate pentru depozitarea pe termen lung.

Pentru prepararea unui medicament pentru prevenirea și tratamentul ser de cal utilizare difteriei hiperimun, la care este fermentat cu pepsină se realizează prin fracționare sare a proteinelor și a balastului Denaturarea proteinelor. Izolarea produsului dorit din serul hiperimun fermentată efectuat cu ajutorul immunosorbent specific care conține ca ligand un toxoid difteric concentrat, purificat. Preparatul se concentrează prin ultrafiltrare pe membrane cu o retenție a greutății moleculare substanțe prag de 100 kD. Filtrarea prin sterilizare se efectuează pe membrane cu un diametru al porilor de 0,22 μm.

EXEMPLUL 1 Imunologie enzimatică a serului hiperimun.

Se introduc 30 l ser de cal hiperimun într-un reactor și se diluează cu 60 l de apă distilată fără pirogen până la un conținut de proteină 3%. Se adaugă, sub agitare, 243 g de pepsină dizolvată într-o cantitate mică de apă distilată acidificată. Proteoliza se efectuează la pH 3,2 la temperatura camerei timp de 1 oră și 1 oră la pH 4,2. (pH-ul este ajustat la 2,5 mol / l dorit cu o soluție de acid clorhidric sau 2,5 mol / l cu soluție de hidroxid de sodiu).

La sfârșitul celei de-a doua ore de proteoliză, în reactor s-a adăugat 14,5% sulfat de amoniu (13 kg) prin orificiul de încărcare, iar pH-ul s-a ajustat la o valoare de 4,3-4,33. Amestecul se încălzește la 56 ° C și se menține la această temperatură timp de 45 minute. După aceasta, enzima este eliberată din proteina de balast prin filtrare prin filtrele de casetă mitkate. Peletul de proteine ​​de balast este îndepărtat și filtratul limpede care conține proteine ​​cu activitate antitoxică este colectat și pH-ul este ajustat la 7,0-7,2.







2. Prepararea imunosorbantului monospecific.

Pentru un preparat standard folosind tsianbromirovannoy imunosorbție Sepharose 4B ( „Pharmacia, Suedia“) și ca un ligand specific - purificat concentrat difterice cu o activitate de 450 Lf / ml. 200 g Sepharose uscate se toarnă în două litri de soluție de acid clorhidric 0,001 mol / l timp de 30 minute și se spală cu conservanți cu aceeași soluție. 1,2 L de toxoid difteric se combină cu precipitatul de sepharoză umflat (900 ml), se amestecă bine și se menține la 4 ° C timp de 24 ore. După aceasta se determină volumul supernatantului (V1) și titrul de toxoid (T1) în reacția de floculare. Dacă titrul nu depășește 10 Lf / ml, decanatul este aruncat, altfel sorbția este continuată. Complexul format Sepharoză - toxoidul spălate de proteine ​​nelegate cu apirogenă sterilă carbonatbicarbonat tampon pH sub 9,0 spectrofotometrie control. Ultima parte a apei de spălare după pH neutru este verificată pentru pirogen, conform unei proceduri convenționale.

In absenta pirogene în apele de spălare grupuri active libere blocate sepharose tsianbromirovannoy doi litri de 1 mol / l soluție etanolamina pH 9,0 timp de două ore într-un loc întunecat cu agitare constantă.

Imunosorbantul este spălat de trei ori cu soluții tampon alternative sterile, fără pirogen: 2 I de acetat de pH 4,0; 2 l bor-borat pH 8,0. Apa de spălare (V1) este monitorizată pentru toxoidul difteric în reacția de floculare (T2). Titrul imunosorbantului se calculează cu formula: unde A este titrul imunosorbant; V, T - volumul și titrul de anatoxină; V1. T1 este volumul și titrul supernatantului; V2. T2 - volumul și titrul apei de spălare; C este volumul imunosorbantului.

Astfel, se obțin 900 ml dintr-o suspensie imunosorbantă cu un titru 588 Lf / ml.

3. Izolarea fracțiunii monoreceptoare a fragmentelor F (ab) 2 ale IgG ale calului, concentrația preparatului.

Pentru a izola fragmentele F (ab) 2 ale IgG, caii folosesc o metodă coloană "Lot". În acest caz, toate recipientele și soluțiile folosite trebuie să fie sterile și fără pirogen. Sorbentul și serul antitox fermentat cu o activitate de 110 UI / ml sunt combinate în cantități echivalente cu titrul
unde V ^. Tf este volumul și titrul enzimei,
Vic .. T.c. - volumul și titrul imunosorbantului.


Ie o parte din imunosorbent este suficientă pentru a epuiza 4,8 litri de ser antitoxic antidifter fermentat.

Sortarea anticorpilor specifici se efectuează la temperatura camerei timp de 1 oră, pH 7,0. Absorbantul spălat liber de proteina nelegată apirogen pH 7,0 soluție salină sterilă tamponată (PBS) la zero prin citirile spectrofotometrice. Dintr-un eluant unui apirogenă PBS steril, se acidulează la pH = 2,2 - 2,4 cu acid clorhidric 1 mol / l.

Imunoabsorbant se spală de proteină cu PBS (pH 7,0) și depozitate într-o soluție sterilă apirogenă tampon boric-borat (pH 8,0) la 4 o C. imunoabsorbant utilizat în mod repetat (de 20 de ori).

Concentrat pentru a da fragmentul purificat 3 litri de afinitate F (ab) 2 IgG de cal cu activitate 2500 UI / ml proteină și 3%. antitoxina concentrată purificată este limpezită prin filtrare succesivă printr-o membrană cu un diametru al porilor 0,8-0,65-0,45 microni. Filtrarea prin sterilizare se efectuează pe membrane cu un diametru al porilor de 0,22 μm. Un preparat steril pentru prevenirea și tratamentul difteriei se toarnă în fiole de 1,0 ml.

Fiole cu pregătirea pentru prevenirea și tratamentul difteriei plasat în primire a casetei și a pus pe o înghețare aparat de temperatură joasă TG contraproductive 50 oferind temperaturi de congelare de cel puțin minus 38 ° C. Atunci când preparare ventilație forțată este congelat timp de cel puțin 18 de ore, fără ventilație forțată este mai puțin de 20 de ore. produs Loading sublimator produse de temperatura condensatorului atingând nu mai mare de minus 50 ° C, rafturi nu mai mari de minus 15 ° C. după aceea sublimator evacuat. punctul dezghețarea droguri minus 33-36 o C. Când temperatura a atins de droguri nu mai mare de minus 38 ° C și un vid de stabilizare nu mai mult de 9 Pa încep vitrinele. O oră după încărcare, încălzirea este la 0 ° C și apoi la 5 ° C pe oră. Temperatura finală a rafturilor de încălzire 34-40 o C. După un repaus de droguri, la zero, temperatură timp de 20 ore de uscare este considerată completă.

Astfel, metoda propusă face posibilă obținerea unui medicament pentru prevenirea și tratamentul difteriei cu reactogenitate redusă, care are proprietăți protectoare ridicate, într-o formă liofilizată.

1. Un preparat pentru profilaxia și tratamentul difteriei, conținând F (ab) 2 fragmente IgG de cal, caracterizat prin aceea că este o fracție monoretseptornuyu F (ab) 2 fragment de anticorpi IgG de cal cu activitate protivodefteriynyh cel puțin 2500 UI / ml și conține ca soluție adjuvant la 0,9% clorură de sodiu la pH 6.8-7.2 în următorul raport de ingrediente:
Fracțiunea monoreceptor a fragmentelor F (ab) 2 ale IgG ale calului cu o activitate anticorp antiflogistică de cel puțin 2500 UI / ml este de 3-4% în greutate
0,9% soluție de clorură de sodiu cu pH 6,8 - 7,2 - până la 1 ml
2. Preparat pentru prevenirea și tratamentul difteriei conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este o formă liofilizată.

3. O metodă de obținere a unui preparat pentru prevenirea și tratamentul difteriei, care cuprinde hidroliza enzimatică cu ser cabalin pepsină hiperimun, caracterizat prin aceea că fermentația este realizată după fracționarea sării și denaturarea proteinelor din zer, izolarea produsului dorit se realizează prin intermediul immunosorbent specific care conține ca ligand un concentrat, toxoid difteric purificat, urmată de concentrare prin ultrafiltrare pe membrane cu o retenție a greutății moleculare substanțe prag 100 D, sterilizarea prin filtrare pe membrane cu un diametru al porilor de 0,22 microni.







Articole similare

Pagina anterioară

Pagina următoare

Trimiteți-le prietenilor: